《Journal of Future Foods》：Secondary metabolite of anthocyanin (Protocatechuic acid) mitigates 2-amino-3-methylimidazole [4, 5-F] quinoline-induced hepatotoxicity via AHR/CYP1A2 axis in vitro and in vivo
编辑推荐：
本研究针对热加工肉类中致癌物IQ（2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹啉）诱导的肝毒性问题，通过体内外实验探究原儿茶酸（PCA）的干预作用。结果表明PCA通过调控AHR/CYP1A2轴抑制IQ代谢活化，进而改善氧化应激、线粒体损伤，并抑制NLRP3炎症小体及NF-κB/MAPK通路激活。该研究为膳食中PCA缓解IQ肝毒性提供了理论依据，对食品安全防控具有重要意义。
在炙烤的烤肉和香喷喷的炸鸡背后，隐藏着一类名为异环胺（Heterocyclic Amines, HCAs）的潜在健康风险物质。其中，2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹啉（IQ）因其在高温烹饪肉类中的普遍存在，并被世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）列为2A类致癌物（即对人类很可能致癌）而备受关注。研究表明，IQ可在体内经过代谢活化后，诱发肝脏氧化应激和炎症反应，从而导致肝损伤，这构成了一个重要的食品安全与公共健康问题。
面对这一挑战，寻找天然、安全的膳食成分来缓解IQ的毒性效应成为了研究热点。原儿茶酸（Protocatechuic Acid, PCA）是一种广泛存在于水果、蔬菜中的天然多酚，是花青素在体内的主要代谢产物之一，已知具有优异的抗氧化和抗炎活性。先前的研究虽已提示PCA能减轻IQ引起的细胞损伤，但其具体的作用机制，尤其是在调节肝脏炎症方面的深层机理，仍不清楚。为了深入揭示PCA的保护作用及其分子通路，广东海洋大学邓红廷等研究人员在《Journal of Future Foods》上发表了其最新研究成果。
为开展此项研究，研究人员综合运用了多种关键技术方法。在细胞层面，使用人肝癌细胞系HepG2作为体外模型，通过MTT法检测细胞活力以确定IQ和PCA的作用浓度。利用生化试剂盒检测超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）等抗氧化酶活性以及丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）水平以评估氧化应激程度。采用DCFH-DA荧光探针和JC-1探针分别检测活性氧（ROS）水平和线粒体膜电位，并通过流式细胞术进行定量分析。通过蛋白质印迹（Western Blot）技术检测NLRP3炎症小体相关蛋白（NLRP3、ASC、Caspase-1）、炎症因子（IL-1β、IL-18）以及NF-κB/MAPK信号通路关键蛋白（p-P38、p-ERK、p-JNK、p-P65）的表达。为探究关键靶点，研究人员使用了小干扰RNA（siRNA）转染技术敲低芳烃受体（AHR）的表达，并利用分子对接模拟分析了PCA与AHR以及IQ与多种细胞色素P450（CYP）酶（包括CYP1A2、CYP2B6等）之间的相互作用。在动物实验中，以C57BL/6雄性小鼠为模型，通过灌胃方式给予IQ和不同剂量PCA，最后取肝脏组织进行相关蛋白表达和生化指标检测。
3.1. PCA对IQ诱导的HepG2细胞氧化应激的缓解作用
研究人员首先确定了IQ（300 μM）可显著降低HepG2细胞活力，而PCA（100 μM）干预能有效逆转此效应。生化分析表明，IQ处理显著抑制了细胞内CAT、GSH、SOD的活性和总抗氧化能力（T-AOC），并提高了H2O2和MDA的水平。PCA干预则显著恢复了抗氧化酶活性和T-AOC，同时降低了H2O2和MDA水平。这些结果说明PCA能有效缓解IQ诱导的细胞氧化应激。
3.2. PCA对IQ诱导的HepG2细胞线粒体损伤的缓解作用
鉴于氧化应激与线粒体功能密切相关，研究发现IQ处理导致细胞内ROS荧光强度显著增强，同时线粒体膜电位下降（JC-1单体增多）。PCA干预则显著降低了ROS水平，并改善了线粒体膜电位。这表明PCA能减轻IQ引起的线粒体损伤。
3.3. PCA对IQ诱导的NLRP3炎症小体和NF-κB/MAPK信号通路活化的影响
Western Blot结果显示，IQ处理显著上调了HepG2细胞中NLRP3炎症小体关键组分（NLRP3、ASC、Caspase-1）及其下游炎症因子（IL-1β、IL-18）的蛋白表达水平。同时，IQ也激活了NF-κB/MAPK信号通路，表现为P38、JNK、ERK和P65蛋白的磷酸化水平升高。PCA干预则显著抑制了上述所有蛋白的异常表达和磷酸化。这表明PCA能够抑制IQ触发的炎症反应。
3.4. AHR调控的CYP1A2蛋白可能是IQ的主要代谢酶之一
分子对接分析显示，IQ与CYP1A2蛋白的结合能最低（-9.3 kcal/mol），提示CYP1A2是代谢活化IQ的关键酶。同时，PCA能与AHR良好结合（结合能为-5.7 kcal/mol）。实验证实，IQ处理降低了HepG2细胞中AHR的蛋白水平，却提高了CYP1A2的表达。PCA干预则恢复了AHR水平并抑制了CYP1A2的表达。FITC标记实验表明PCA能进入细胞核。
3.5. PCA通过调节AHR活化缓解IQ诱导的HepG2细胞氧化应激
通过siRNA转染敲低AHR表达后，PCA对CYP1A2表达的抑制作用被削弱。同时，PCA对IQ诱导的抗氧化酶活性下降及H2O2、MDA水平升高的缓解作用也显著减弱。这证明PCA的抗氧化作用依赖于AHR。
3.6. PCA通过直接调节AHR活化抑制IQ诱导的NLRP3炎症小体和NF-κB/MAPK信号通路活化
在AHR被敲低后，PCA对NLRP3炎症小体组分（NLRP3、ASC、Caspase-1）、炎症因子（IL-1β、IL-18）以及NF-κB/MAPK信号通路关键蛋白磷酸化的抑制作用均被逆转。这进一步证实PCA的抗炎作用是通过AHR介导的。
3.7. PCA抑制IQ诱导的小鼠肝脏中AhR和CYP1A2的活化
动物实验发现，灌胃IQ可降低小鼠肝脏AHR表达，升高CYP1A2表达。低剂量PCA（10 mg/kg）干预能显著逆转这一变化，而高剂量PCA（20 mg/kg）效果不佳。
3.8. PCA缓解IQ诱导的小鼠肝脏氧化应激
与体外结果一致，IQ引起小鼠肝脏抗氧化酶（CAT、GSH、SOD）活性和T-AOC下降，以及H2O2和MDA水平升高。低剂量PCA干预能有效改善这些氧化应激指标，高剂量PCA效果有限。
3.9. PCA对IQ诱导的小鼠肝脏NLRP3炎症小体和NF-κB/MAPK信号通路活化的影响
IQ激活了小鼠肝脏的NLRP3炎症小体和NF-κB/MAPK信号通路。低剂量PCA能显著抑制这些通路关键蛋白的表达和磷酸化，而高剂量PCA的抑制效果减弱或不显著。
3.10. 相关性分析
蛋白互作网络和Spearman相关性分析显示，AHR表达与抗氧化酶活性呈正相关，与NLRP3炎症小体、NF-κB/MAPK通路蛋白及CYP1A2表达呈负相关。CYP1A2表达则与炎症指标呈正相关，与抗氧化指标呈负相关。这从统计学角度证实了AHR-CYP1A2轴在PCA缓解IQ肝毒性中的核心地位。
综上所述，本研究通过系统的体内外实验阐明，膳食成分PCA能够通过靶向AHR，进而抑制CYP1A2对IQ的代谢活化，最终通过增强抗氧化防御、改善线粒体功能、抑制NLRP3炎症小体组装及NF-κB/MAPK信号通路激活等多重机制，有效减轻IQ诱导的肝毒性。一个有趣的发现是，低剂量PCA显示出比高剂量更好的保护效果，提示其在膳食干预中可能存在最佳有效剂量范围。这项研究不仅深化了对IQ毒理机制的认识，更重要的是为利用天然食物成分PCA预防或缓解膳食中异环胺带来的健康风险提供了坚实的科学依据和潜在的应用策略，对于推动功能性食品开发和保障食品安全具有重要的理论价值和实践意义。
