《Journal of Nutrition Education and Behavior》：Targeting xCT-mediated amino acid metabolism: A novel mechanism of silymarin in ameliorating MAFLD-associated ferroptosis
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MAFLD小鼠模型和肝细胞实验表明，水飞蓟素通过靶向xCT抑制铁依赖性脂质过氧化，减少MDA和ROS，提升GSH水平，改善肝脂沉积和炎症，同时调节肝脏氨基酸代谢。
徐红莉|孙吉|丁宁|张电宝|李一玲
中国医科大学第一医院，中国辽宁省沈阳市和平区南京北路155号，110001
摘要
背景
代谢功能障碍相关性脂肪肝病（MAFLD）影响了全球约25%的人口，造成了巨大的经济负担。水飞蓟素是一种传统的欧洲草药，具有已知的肝脏保护作用，但其在治疗MAFLD方面的潜力尚未得到充分探索。
方法
通过喂食高脂饮食（HFD）的MAFLD小鼠和棕榈酸（PA）诱导的HepG2细胞，研究了水飞蓟素在体内和体外的作用机制。使用HE和Oil Red来检测肝脏的脂毒性损伤。通过相应的试剂盒测量谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、铁和活性氧物种（ROS）的水平，以验证铁死亡（ferroptosis）的状态。通过Western blot、qPCR、免疫组织化学和免疫荧光验证水飞蓟素的作用靶点。应用靶向氨基酸代谢组学技术，通过LC-MS/MS检测肝脏中的氨基酸变化。
结果
水飞蓟素减少了MAFLD小鼠的体重和脂肪积累。MDA和ROS水平的降低以及GSH水平的升高表明水飞蓟素减轻了肝脏的铁死亡。xCT是水飞蓟素在MAFLD中的重要靶点。半胱氨酸缺乏实验表明半胱氨酸在水飞蓟素治疗中起着关键作用。此外，水飞蓟素处理还导致了肝脏中氨基酸的重新编程。
结论
这些结果表明，水飞蓟素通过靶向xCT和抑制铁死亡来缓解MAFLD。水飞蓟素对氨基酸的改变为MAFLD的治疗提供了新的线索。
引言
代谢功能障碍相关性脂肪肝病（MAFLD），以前称为非酒精性脂肪肝病（NAFLD），是一个日益严重的问题，影响着全球超过四分之一的人口（1）。MAFLD的范围从单纯的脂肪变性到代谢相关性脂肪性肝炎（MASH）、肝硬化，甚至肝细胞癌（2,3）。MAFLD的发病机制和进展是由于个体遗传易感性与多种环境因素的协同作用。MAFLD由脂毒性、活性氧物种（ROS）的积累、线粒体功能障碍、内质网（ER）应激和肠道微生物群失调共同驱动（4）。尽管在这些领域进行了大量研究，但有效的治疗干预措施和精确的分子靶点仍然难以确定。
铁死亡是一种程序性细胞死亡形式，其特征是铁依赖性的脂质过氧化。细胞内不稳定的铁积累会催化Fenton反应，产生过多的自由基和ROS。此外，酰基辅酶A合成酶长链家族成员4会驱动脂质过氧化，最终破坏细胞膜的完整性（5）。另一方面，细胞脂质过氧化物可以通过谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）选择性地清除。谷胱甘肽（GSH）是GPX4的重要辅因子，同时还能清除细胞内的ROS。GSH的生物合成需要甘氨酸、半胱氨酸和谷氨酸作为底物（6）。由于细胞内半胱氨酸的供应有限，细胞主要依赖于半胱氨酸/谷氨酸反向转运系统Xc?来导入细胞外的半胱氨酸，同时输出谷氨酸。该系统Xc?由转运亚基SLC7A11（xCT）及其调节亚基组成。
2024年3月14日，美国FDA批准了首个用于成人MASH（伴有肝纤维化的情况）的药物，该药物与饮食和运动联合使用（7）。然而，这种药物的长期效果仍需进一步验证，且其相对较高的成本可能会限制其可及性。许多天然产物及其衍生物已被证明对缓解MAFLD有效。菊粉调节了MAFLD小鼠的肠道微生物群组成和微生物代谢物。同时，菊粉抑制了M1巨噬细胞的极化，从而延缓了疾病进展（8）。亚麻籽改变了肠道胆汁酸谱型，并激活了肠胆汁酸受体TGR5，有效预防了MAFLD相关的炎症（9）。水飞蓟素是一种从Silybum marianum（L.）Gaertn.种子中提取的天然黄酮类木脂素化合物，早在两千年前就在古希腊被发现（10）。标准化的水飞蓟素含有多种黄酮木脂素，如水飞蓟宾、水飞蓟苷、水飞蓟克里斯汀、脂肪酸、多酚化合物和黄酮类（11）。作为一种天然活性成分，水飞蓟素具有多种作用——解毒（12）、抗病毒（13）、抗癌（14）和抗疲劳（15）。然而，水飞蓟素最广泛研究和应用的功能仍然是其肝脏保护作用。临床研究表明，水飞蓟素可以改善MASH患者的肝脂肪变性、气球样变性和纤维化（16）。水飞蓟素的肝脏保护作用机制包括抗氧化活性（17）、线粒体保护（18）和维持膜稳定性（19），这些机制与铁死亡的特点部分重叠。这似乎表明水飞蓟素与铁死亡之间存在潜在关联。
在本研究中，我们探讨了水飞蓟素在体内和体外对MAFLD的影响，并发现了水飞蓟素对xCT和氨基酸代谢的调控机制。
实验部分
小鼠实验
雄性C57BL/6J小鼠，正常饮食（ND, H10010）和高脂饮食（HFD, H10060）均购自HFK Bioscience（北京，中国）。所有实验小鼠均在标准化条件下饲养（22±1°C，55±5%湿度），并控制光照周期（12小时光照：12小时黑暗）。适应两周后，小鼠被随机分为4组（每组n=6），包括ND+生理盐水、ND+水飞蓟素、HFD+生理盐水和HFD+水飞蓟素。水飞蓟素通过灌胃给药，生理盐水作为对照。
水飞蓟素改善小鼠的肝脂肪变性
为了评估水飞蓟素对MAFLD的治疗效果，C57BL/6J小鼠被喂食高脂饮食（HFD）以建立MAFLD模型。喂食两周后，每天给予200毫克/千克的水飞蓟素（图1A），结果发现HFD诱导的小鼠的肝脏和体重均有所减轻（图1B, C）。补充水飞蓟素后，血清中的TG、LDL和ALT水平也有所下降，但血清AST水平没有显著变化（图1D-G）。我们推测水飞蓟素可能
讨论
迄今为止，Rezdiffra是唯一获得FDA批准用于治疗中度至重度NASH的药物，需与饮食和运动联合使用。然而，它并不适用于所有MAFLD患者，这突显了探索其他MAFLD药物治疗方法的必要性。在本研究中，水飞蓟素显著降低了HFD喂养小鼠的肝脏和体重，并降低了血清中的TG、ALT、AST和LDL水平。此外，水飞蓟素显著改善了肝脏的炎症和气球样变性
结论
本研究系统评估了水飞蓟素在MAFLD相关铁死亡中的作用。我们的结果表明，水飞蓟素通过激活xCT抑制了铁死亡30%。水飞蓟素的机制依赖于氨基酸的变化。这些发现为水飞蓟素治疗MAFLD提供了新的视角，并提示了水飞蓟素与半胱氨酸联合使用的潜在方向。
伦理批准和参与同意
动物研究方案已获得中国医科大学伦理委员会的批准（CMU20240373）。
数据和材料的可用性
由于实验室的政策和保密协议，本研究中生成和/或分析的数据集不对外公开，但可根据合理请求向通讯作者获取。资助
本研究由非传染性疾病-国家科学技术重大项目（2023ZD0508703）、辽宁振兴人才计划（XLYC2412033）和辽宁省教育厅科研基金（LJKMZ20221167）资助。作者贡献
YL和DZ负责本研究的可视化和监督；JS、HX和ND进行了实验；JS和HX组织并分析了数据；HX撰写了初稿；JS审阅并编辑了手稿。所有作者均阅读并批准了最终版本的手稿。补充图1。（A-C）检测铁死亡相关标志物：GSH、MDA、铁含量。细胞在PA诱导的HepG2中分别接受或不接受水飞蓟素和erastin的共同处理24小时。（D, E）检测TC和TG的变化
CRediT作者贡献声明
徐红莉：撰写——初稿、软件、项目管理、方法学。孙吉：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、项目管理。丁宁：项目管理、方法学。张电宝：监督、方法学、概念构思。李一玲：研究、资金获取、概念构思。利益冲突声明
所有作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
