《Journal of Structural Biology: X》：Salt bridge disruption in colicin Ib channel-forming domain enhances membrane translocation and bactericidal activity
编辑推荐：
本研究通过解析大肠杆菌素Ib（ColIb）通道结构域的晶体结构，发现其螺旋间盐桥网络（H3-H7/H4-H6）对维持三级结构稳定性至关重要。通过丙氨酸突变和酸性pH破坏盐桥相互作用，可诱导蛋白部分解折叠，显著增强ColIb的全长及独立C结构域对大肠杆菌的杀菌活性（提升超10倍），揭示了ColIb通过CirA受体实现跨膜转运的结构基础。该研究为设计新型抗菌策略提供了新思路。
在微生物世界的生存竞争中，大肠杆菌会分泌一类名为"大肠杆菌素"的细菌素来消灭竞争对手。这类蛋白质能像特工一样潜入目标细菌细胞，在其内膜上形成离子通道，导致膜电位崩溃、离子泄漏，最终引发细胞死亡。其中，孔形成大肠杆菌素（如ColIb）由三个结构域组成：N端转运结构域负责穿越外膜，中央受体结构域识别目标细胞表面的CirA受体，C端通道形成结构域则执行最终的膜穿孔任务。尽管科学家们已对其可溶性结构和膜穿孔活性进行了深入研究，但ColIb如何通过结构重排实现外膜转运和内膜孔形成的具体机制仍是一个未解之谜。
为了解决这一难题，台湾中兴大学与中央研究院微生物基因组学博士项目的研究团队在《Journal of Structural Biology: X》上发表了最新研究成果。他们成功解析了ColIb通道结构域的晶体结构，首次发现其螺旋间存在关键的盐桥相互作用网络，并证明破坏这些静电相互作用能显著增强蛋白的膜转运效率和杀菌活性。
研究团队主要运用了以下关键技术：X射线晶体学解析ColIb C结构域三维结构；差示扫描荧光法监测蛋白热稳定性；荧光光谱分析疏水核心暴露程度；尿素诱导平衡解折叠实验计算自由能变化；脂质体共沉淀评估膜结合能力；菌落形成单位计数和点样法测定杀菌活性。
晶体结构揭示ColIb C结构域的盐桥网络
通过3.11埃分辨率的晶体结构，研究人员发现ColIb C结构域采用10个α螺旋组成的三层拓扑结构。特别值得注意的是，在螺旋H3-H4和H6-H7之间形成了保守的盐桥网络（如Asp491-Arg565、Glu521-Lys560等），这些相互作用在E1型大肠杆菌素中高度保守，但在A型中不存在。结构比较显示，ColIb与ColIa、ColE1的均方根偏差较小（1.322-1.661埃），而与A型成员偏差较大（3.312-4.289埃）。
破坏盐桥相互作用降低构象转变能垒
通过将参与盐桥的酸性残基突变为丙氨酸，研究人员发现所有突变体（D491A、D562A等）的热稳定性均显著降低，其中D562A突变影响最为显著。尿素解折叠实验进一步证实，突变体的解折叠自由能ΔGU(H2O)在pH 6.0时明显低于野生型（如D562A为12.9±0.8 kcal·mol-1，野生型为21.4±1.4 kcal·mol-1）。脂质体结合实验表明，盐桥破坏使蛋白在更高pH条件下即可发生膜结合，提示其更易发生构象转变。
盐桥突变增强全长ColIb的杀菌活性
在铁螯剂2,2′-联吡啶诱导CirA表达的条件下，0.01 nM浓度的盐桥突变体即可产生比野生型强10倍以上的杀菌效果。值得注意的是，D562A虽具有最强的解折叠倾向，但其杀菌活性并非最高，研究人员推测这可能是因为过强的膜结合导致蛋白在外膜发生非特异性滞留。
酸性pH激活的C结构域实现不依赖T/R结构域的转运
最令人惊讶的发现是，在pH 4.5条件下纯化的独立C结构域（不含T和R结构域）竟能通过CirA依赖的方式杀死目标细菌。竞争实验表明，提前加入含有T-R结构域的截短体可抑制这种杀伤作用，证明其仍依赖CirA作为转运通道。这颠覆了传统认为必须依赖完整T-R结构域才能实现转运的认知。
研究结论表明，ColIb C结构域中的盐桥网络如同一个"分子锁"，维持其在生理pH下的稳定构象。在酸性环境或突变破坏下，盐桥网络的瓦解降低了蛋白解折叠的能量壁垒，促进其通过CirA通道实现跨膜转运。这一发现不仅阐明了孔形成大肠杆菌素的跨膜机制，也为设计新型抗菌药物提供了重要启示：通过理性设计调控蛋白结构的稳定性，可能实现对其膜穿孔活性的精确控制。该策略在抗菌、抗真菌乃至抗肿瘤治疗中均具有广阔的应用前景。
