《Aggregate》：Molecular Crowding-Driven RNA Condensates Enable F?rster Resonance Energy Transfer-Enhanced Small-Molecule Sensing
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本文报道了一种基于分子拥挤效应的无标记FRET增强型荧光RNA凝聚体（F-FARCON）平台，通过中性分子拥挤剂（如PEG8K）和RNA结构基序诱导多价相互作用，实现小分子的高灵敏度检测。该平台利用硫黄素T（ThT）作为FRET供体，与组胺响应型RNA适体结合，显著提升信噪比（动态范围达970倍）和检测灵敏度（检测限15.36 nM），并成功集成于冻干纸基便携设备，为食品安全和生物医学诊断提供了低成本、可现场部署的传感新策略。
2.1 用于组胺检测的无标记FRET增强型荧光适体RNA开关
为提升RNA荧光适体的信号转导效率，研究团队设计了一种以ThT为FRET供体、Pepper-HBC530为受体的无标记FRET系统。光谱分析显示ThT的激发光谱与HBC530/HBC599的发射光谱高度重叠，表明能量转移的可行性。通过将组胺适体整合至Pepper适体的茎环区域，构建了组胺响应型RNA开关。当组胺结合时，构象重排激活Pepper适体的荧光，同时ThT结合至邻近的嘌呤富集区，形成供体-受体距离小于10纳米的单链FRET系统。热力学分析表明，具有正ΔΔG值的传感器（如Sensor 1）展现出最大荧光动态范围（8.3倍）。分子对接模拟进一步揭示了组胺诱导的Pepper正确折叠可促进HBC530的π-π堆积相互作用。优化后的系统在0.1 μM ThT浓度下实现80.3倍荧光增强，远高于非FRET系统的34.2倍。
2.2 FRET增强型荧光适体RNA开关的检测性能
该开关对组胺表现出高特异性，其结构类似物（如L-组氨酸、酪胺等）均未引发显著信号。灵敏度测试显示，FRET增强系统在0.1–200 μM范围内呈线性响应（R2= 0.99），检测限为73.69 nM，而非FRET系统的线性范围为5–1000 μM，检测限为2.818 μM。这表明ThT的引入可在不改变RNA序列的前提下调控检测范围与灵敏度。
2.3 分子拥挤驱动的F-FARCON用于高性能小分子检测
研究采用不同分子量的聚乙二醇（PEG）作为拥挤剂，发现2.5% PEG8K可显著提升信号幅度（荧光增强约970倍）。拥挤环境通过排除体积效应增强RNA-配体相互作用，使组胺的表观解离常数（Kd）从551 μM降至339 μM，最大反应速率（Vmax）提升2.08倍。热力学分析表明，拥挤条件下结合过程以焓驱动为主（ΔHθ= -4.48 kcal/mol），熵项贡献减弱（TΔSθ= -0.45 kcal/mol），提示拥挤环境促进了特异性相互作用。圆二色谱（CD）分析进一步证实PEG8K增强了碱基堆积作用，但不改变RNA整体结构。
2.4 GC基序引导的F-FARCON组装
激光共聚焦显微镜显示，2.5% PEG8K可促进RNA开关形成直径约6微米的凝聚体。荧光漂白恢复（FRAP）实验表明凝聚体处于部分固定的粘弹性状态（恢复率24%），介于液态滴与凝胶态之间。NUPACK预测及天然电泳分析证实RNA可通过GGCC基序形成二聚体及高阶寡聚体，PEG8K使二聚体比例从14%升至38%，说明拥挤环境通过增强链间配对驱动凝聚体形成。
2.5 自适应F-FARCON在复杂基质中的高灵敏度检测
该平台在尿液、鱼类提取物和葡萄酒等复杂基质中仍保持高选择性，对组胺的检测限达15.36 nM（HBC530）和28.52 nM（HBC599）。通过替换识别模块，系统可重构用于S-腺苷甲硫氨酸（SAM）检测，检测限分别为70.33 nM和115.9 nM。在实际样品加标实验中，回收率达92.4%–114.9%，验证了其在食品和临床样本中的可靠性。
2.6 冻干F-FARCON集成便携设备用于现场组胺检测
研究将F-FARCON反应体系冻干于纸基芯片，构建了无需仪器的便携式检测装置。样品通过毛细作用吸入反应室，7分钟内即可实现双通道（绿/橙光）荧光读数。该设备在-20°C下储存25天后信号保留率超过93%，且对组胺类似物具有高特异性，在50–1000 μM范围内呈现剂量依赖性响应，为现场快速检测提供了实用解决方案。
3 结论
F-FARCON平台通过整合分子拥挤效应与RNA结构工程，实现了小分子的高灵敏度、可调检测。其模块化设计允许通过替换识别单元扩展靶标范围，而冻干纸基设备进一步推动了其在现场检测中的应用，为食品安全和生物医学诊断提供了新技术路径。
4 实验方法
RNA通过体外转录合成，检测在含40 mM HEPES、100 mM KCl、1 mM MgCl2（pH 7.0）的缓冲体系中进行。分子对接、CD分析、FRAP等实验均采用标准流程。便携设备通过激光切割三层结构（PVC顶层、粘合剂流道层、亲水玻璃基层）组装而成，荧光信号通过成像系统或3D打印光箱采集。
