《Ecology and Evolution》：Population Structure and Genetic Diversity Analyses Reveal Isolation That May Imperil the Northernmost Colony of the Endangered Australian Sea Lion
ABSTRACT
海洋环境正经历快速变暖，显著改变生态系统。物种分布范围边缘的种群更容易受到环境变化的影响，因为它们首先受到影响，且可能具有有限的扩散机会。这种脆弱性在具有特殊觅食和繁殖策略的物种中可能加剧。澳大利亚海狮（Neophoca cinerea）是一种濒危的耳海豹科物种，在澳大利亚南部约3000公里的范围内繁殖。在该物种分布的最西北边缘，澳大利亚海狮在西澳大利亚州的热带-温带地区——受海洋热浪影响的豪特曼阿布罗柳斯群岛内的多个岛屿上繁殖。本研究旨在检查来自豪特曼阿布罗柳斯群岛的澳大利亚海狮与物种范围内其他种群相比的遗传结构和多样性。对来自西澳大利亚州和南澳大利亚州19个采样点的125只个体（其中19只来自豪特曼阿布罗柳斯）进行了基因分型。我们的研究结果表明，来自豪特曼阿布罗柳斯的个体归为一个单一的种群，该种群高度分化且遗传多样性极低。豪特曼阿布罗柳斯澳大利亚海龙种群的孤立和有限的遗传变异表明它极易遭受局部灭绝。我们的研究强调了物种的孤立种群对快速环境变化和随机事件的脆弱性。
1 Introduction
在一个快速变暖的世界中，生物体正试图通过改变其地理分布范围来生存。海洋环境正在经历比陆地生态系统更快的急剧变化。高度动态的海洋吸收了90%以上人为产生的热量，这正在推动沿海和海洋系统的显著变化。海洋热浪——海洋温度异常高的时期——在世界范围内变得更加频繁、持续时间更长且强度增加。先前稳定海洋生态系统的边界流正以快于海洋平均速度的速度变暖，引发不可预测的天气系统，改变着海洋盆地的海岸线。海洋生物似乎特别容易受到这些不稳定和快速变化的影响，许多种群正在重新分布、碎片化、收缩或灭绝。更为严峻的是那些中心地点觅食者，如繁殖海鸟和雌性耳海豹科动物（海狗和海狮）。
了解种群结构是识别对环境变化潜在脆弱性的一种方法。遗传标记可用于确定种群结构、遗传多样性并验证分布范围变化。高度分化和碎片化的种群，通常包括那些处于物种分布范围 trailing edge 的种群，更容易发生变化，因为它们可供混合的个体有限，并且可能在物种范围内收缩或无处可扩展。由于连通性有限，边缘种群通常具有较低的遗传多样性和相对较高的近交水平，从而增加了灭绝风险。确定物种的连通性有助于评估范围有限的动物群体对当前和未来气候变化的适应能力，从而协助保护行动。
澳大利亚海狮（Neophoca cinerea）是澳大利亚唯一特有的濒危海豹物种。近期的种群趋势表明该物种持续衰退。种群分散在约3000公里的海岸线上：南澳大利亚州（SA）拥有该物种82%的幼崽产量，分布在48个现存繁殖地；而西澳大利亚州（WA）拥有18%的幼崽产量，分布在32个繁殖地。该物种的生活史带来了巨大的保护和管理挑战，加剧了气候变化威胁的影响。澳大利亚海狮具有多个可能阻碍迁移或重新分布的特征：两性都具有归巢习性；该物种在地理上接近的群落之间具有漫长且不同步的繁殖季节；个体终生保持对底栖觅食地的忠诚度；雌性在照顾幼崽时进行相对短时间的觅食行程（约2天）。因此，位于物种分布范围边缘、邻近种群有限且暴露于极端气候事件环境中的种群可能最为脆弱。此外，种群增长率和规模受到渔业相互作用（尤其是在底栖刺网和岩龙虾笼中的兼捕）、被海洋垃圾缠绕以及疾病的影响。澳大利亚海狮因多方面的危害（栖息地适宜性变化、疾病爆发和极端天气事件）和巨大的知识差距而被评为气候紧迫性的最高风险类别。
在该物种最北端的西澳大利亚州繁殖地，有一个由约150个低洼珊瑚礁岛屿和小岛组成的群岛，延伸超过约2500平方公里，称为豪特曼阿布罗柳斯群岛（下文简称阿布罗柳斯）。该地区的海狮在19世纪初曾被大量捕猎。自那以后有所恢复，最近（2023年）的统计估计有120只个体。这个位于印度洋的温带-热带群岛是在更新世-全新世过渡期间（约15,000至7,000年前）由于全球主要冰川融化导致海平面上升而形成的。地理上的孤立以及环礁和岛屿的碎片化形成可能为海狮在其分布范围的西部WA区域提供了可用栖息地。阿布罗柳斯暴露于卢因暖流之下，这是一股沿着WA海岸线向南流动的温暖、低盐度、营养贫乏的连续边界流。卢因暖流经历了变暖的拉尼娜事件，包括2011年一次显著的热浪事件。该热浪与许多鱼类和无脊椎动物群落的死亡、收缩和向南重新分布相关。因此，全球变暖及其相关的海洋热浪很可能对当地的澳大利亚海狮产生负面影响。
检查阿布罗柳斯澳大利亚海狮群体的种群遗传学对于理解该种群对历史和当前压力的脆弱性至关重要。大约30多年前，曾通过线粒体DNA（mtDNA）评估了阿布罗柳斯群体的遗传结构。这很难与使用核标记（如微卫星或单核苷酸多态性（SNP））评估的其他种群进行比较。mtDNA分析揭示了与WA朱里恩湾地区（约200公里以南）繁殖群共享的单倍型，表明存在来自阿布罗柳斯以外地点的雌性补充。使用SNP的进展提供了双亲遗传的多样性标记，显示了更近的基因交流迹象，并且与mtDNA相比，具有检测种群分化的更高分辨率。
鉴于阿布罗柳斯澳大利亚海狮的地理隔离、该物种的生活史、历史及潜在威胁以及气候变化日益增加的压力，我们假设这群动物在遗传上是孤立的。为了验证这一点，我们对SA和WA的繁殖地的幼崽进行了采样，并完成了SNP分析。我们旨在揭示位于该物种分布范围西部和北部边缘的阿布罗柳斯澳大利亚海狮群体相对于其他种群的遗传结构和多样性，这些重要信息将有利于它们的保护和管理。鉴于该群体的地理位置和生活史，我们假设阿布罗柳斯群体将（1）在遗传上独特，反映出与其他群体的低连通性；（2）相对于在其他地点采样的海狮群体，具有较低的遗传多样性。
2 Methods
2.1 Study Area and Sampling
在2022年2月至2023年5月期间，从WA和SA偏远岛屿的150只澳大利亚海狮幼崽（138只存活，12只死亡）收集了组织样本。大多数幼崽未完全换毛（<6个月大），因此无法在群落间扩散，从而优化了采样个体出生于所访地点的置信度。五只幼崽大约6-18个月大，不太可能已经扩散。我们总共从21个岛屿采样。在SA，我们从七个繁殖地采样：Nuyts Reef north, West Waldegrave Island, Olive Island, Lewis Island, Dangerous Reef, Seal Bay on Kangaroo Island, and The Pages south。在WA，我们从朱里恩湾地区的三个繁殖地采样：Beagle Island, North Fisherman Island, and Buller Island，以及来自阿布罗柳斯的11个岛屿：Square Island（南Pelsaert群）和Gilbert, Serventy, Morley, Large Helms, Stokes, White, Suomi, Keru, South Bynoe, and Leo Islands（来自Easter Group）。选择这些采样点是为了比较地理区域内和之间的遗传多样性和结构。鉴于每个地点的幼崽群体规模小，阿布罗柳斯内的所有繁殖地点都被定为采样目标。后勤限制限制了对WA南海岸繁殖地的采样。
采样获得了麦考瑞大学动物伦理委员会（2021/024）和南澳大利亚州政府初级产业和地区伦理委员会（#16/20）的伦理许可，以及南澳大利亚州环境与水资源部（A27144和A24684）和西澳大利亚州生物多样性、保护与景点部（TFA 2022-0020）的野生动物许可。
2.2 Tissue Collection
活体幼崽在其母亲不在时通过手工或网具捕获。我们使用无菌手术刀片或活检穿孔器从后鳍肢收集1-5毫米的组织。每只被采样幼崽背部的毛发被剪掉以便识别，避免重复采样。组织立即存放在含有95%-100%乙醇的2毫升微量离心管中。在野外工作和旅行期间，样品存放在带有冰袋的冷却箱中，或在可用时存放在-15°C的冷冻器中，直至能够分析前存放在-30°C。
2.3 DNA Extraction and Sequencing
总共150个组织样本，加上23个个体的重复样本（总共173个样本），被送往Diversity Arrays Technology Pty. Ltd.（DArT，堪培拉，澳大利亚）进行DNA提取、DArTseq测序和SNP基因分型。DArTseq是一种下一代测序方法，使用限制性内切酶PstI（5′-CTGCA|G-3′）和SphI（5′-GCATG|C-3′）进行复杂性降低，靶向基因组的非重复区域。测序在Illumina NovaSeq 6000和NovaSeq X Plus上进行。所有数据均以138 bp读长的单端读取形式生成。SNP基因分型使用DArT Pty Ltd.的专有分析流程进行。DArT的技术不依赖于参考基因组。DArT过程的更多细节见Georges等人（2018）。经过DArT的初步过滤后，从代表142只幼崽的163个样本中保留了18,297个SNP位点。由于DNA浓度低（很可能与组织质量有关），五个WA个体和三个SA个体的样本被丢弃。
2.4 SNP Calling and Data Filtering
在进行针对我们目标和研究设计的额外过滤之前，我们使用生物学重复样本（19个，因为四个失败）来检测R v4.3.3中不匹配的位点（平均错误率=4.51%）；1063个在两个或更多重复中不匹配的SNP从整个数据集中被移除。如果一个重复样本的检出率低于80%，则将其从后续分析中移除。如果两个重复的检出率都高于80%，则每个个体随机选择一个重复。
使用R包“dartR”进行了进一步过滤，顺序如下。检出率非常低（<35%）的八个样本被移除。另外11个被认为是低质量（检出率<68%）的样本也被移除。我们尽可能保留阿布罗柳斯的个体，以免损害我们研究设计的主要目标，该设计以这个范围边缘的群岛为中心。通过检查数据集的“genlight reports”和smear图来确定以下过滤步骤的阈值。我们移除了重复性计数低（<90%可重复性）和高缺失数据（位点检出率<80%）的SNP。为了减少假纯合子呼叫的可能性，我们保留了在所有个体中具有高序列读取数的SNP（>3且<13读取深度）。我们移除了测序片段内的次要SNP，以及次要等位基因频率（MAF）<0.012%的位点（即，保留在数据集中至少出现三次、至少在两个个体中出现的等位基因[3/2N]）。我们测试了性别连锁位点，没有发现强有力的证据表明任何剩余的位点是性别连锁的。在至少一半种群（其中n>5）中显著偏离哈迪-温伯格平衡的SNP从整个数据集中被移除。最终数据集包含来自19个采样点125个个体的2288个SNP用于分析。
2.5 Population Structure
我们使用三种聚类方法调查了澳大利亚海狮的种群结构。为了可视化个体之间的遗传相似性，我们使用了基于距离的无监督主坐标分析，遵循Georges等人的方案。首先，我们分析所有个体 together，然后将数据子集化为WA内的采样点（38只幼崽，采样点=12）和SA内的采样点（87只幼崽，采样点=7），以确定是否存在嵌套群体或亚结构。
为了可视化采样点之间的遗传相似性，我们使用邻接法构建了一个无根表型树。该方法将数据转换为频率矩阵，并计算密切相关的个体组之间的欧几里得距离以生成系统发育图。
为了确定采样点的个体是否代表不同的遗传群体，我们使用了基于贝叶斯模型的无监督聚类算法STRUCTURE v2.3。对每个可能的群体数（K）从2到19（采样的群落总数）运行10次，使用50,000的burn-in周期和100,000次马尔可夫链蒙特卡洛迭代重复，不设混合。我们运行函数时不设混合，因为此选项对于检测细微结构更有效。使用了替代的祖先模型参数，因为采样点之间的样本量不同，并且已知澳大利亚海狮在群落内有密切相关的个体。使用参数POPALPHAS=1来解释采样点之间不平衡的采样，并使用LOCPRIOR=1来解释小样本量以及某些采样点对之间的密切关系。使用基于连续K值之间对数概率变化率的Evanno方法推断最佳聚类数。然后，使用从ΔK推断出的最佳聚类数，通过CLUMPAK方法将该数量的遗传聚类中的个体进行聚合和可视化。为了确定WA内是否存在种群细分的证据，随后按照Pritchard等人和Janes等人的建议，使用WA内的数据子集进行了分层分析。我们使用与完整数据集分析相同的设置和方法（在STRUCTURE中将K范围调整为1-12）。
2.6 Measures of Genetic Differentiation and Diversity Between Identified Genetic Clusters
为了评估种群间的基因流，我们计算了固定指数（FST）并执行了200次bootstrap以获取95%置信区间。为了量化已识别种群内的遗传多样性，我们测量了期望杂合度（HE）、观测杂合度（HO）和种群水平近交系数（FIS）及其标准误。
3 Results
3.1 Population Structure
澳大利亚海狮在地理区域之间显示出强烈的遗传结构。最大的分化发生在WA和SA种群之间，每个区域内都发现了亚结构。在WA内，PCoA2显示阿布罗柳斯采样点的个体与来自Buller、Beagle和North Fisherman Islands的个体之间存在差异。这个结果在树状图中也被观察到，该图有两条明显的祖先线。STRUCTURE分析将个体分配到WA和SA的六个遗传聚类中（ΔK=6），并在完整数据集和仅WA分析中，将WA内的个体分配到两个遗传聚类中（ΔK=2）。
在WA内，所有从阿布罗柳斯采样的个体都被分配到一个独特的遗传聚类。所有来自朱里恩湾地点（North Fisherman, Buller and Beagle Islands）的个体被分配到第二个聚类，但有30%的概率属于阿布罗柳斯幼崽被分配到的那个聚类。SA的个体被完全或部分地分配到四个聚类之一。12只Olive Island个体中，有11只与所有West Waldegrave Island和Nuyts Reef个体聚为一类。10只Dangerous Reef个体中，有9只与所有Lewis Island个体聚为一类。大多数来自The Pages的个体（n=15/16）主要被分配到一个独特的聚类（70%-80%的分配率），并部分分配给Dangerous Reef/Lewis Island聚类（20%-30%的分配率）。一只来自The Pages的个体主要分配给Dangerous Reef/Lewis Island聚类（70%概率，30%给The Pages聚类）。在Seal Bay个体中，65%（n=11/17）被分配到一个独特的聚类，而另外35%主要（80%-90%概率）与Dangerous Reef/Lewis Island聚类个体聚集，并部分（10%-20%概率）与The Pages的独特聚类聚集。一只Olive Island和一只Dangerous Reef幼崽都（100%概率）分配给了独特的Seal Bay聚类。
考虑到三种分析方法，我们建议六个遗传聚类，按地理顺序从西到东为：（1）阿布罗柳斯的所有九个岛屿，（2）Beagle, North Fisherman and Buller Islands，（3）Nuyts Reef, Olive and West Waldegrave Islands，（4）Lewis Island and Dangerous Reef，（5）Seal Bay和（6）The Pages。下文我们将分别称这些为种群：（1）阿布罗柳斯，（2）朱里恩湾，（3）西艾尔半岛，（4）南斯宾塞湾，（5）Seal Bay和（6）The Pages。
六个遗传聚类之间遗传分化程度最高的是阿布罗柳斯和The Pages之间，它们分别位于物种分布范围的西北和东南边缘。WA内的两个种群，阿布罗柳斯和朱里恩湾，彼此高度分化，并且与SA的所有其他聚类高度分化。在SA内，Seal Bay与西艾尔半岛和The Pages存在遗传分化，但与南斯宾塞湾没有分化。The Pages、斯宾塞湾和西艾尔半岛种群之间的分化水平较低。
3.2 Genetic Diversity
在SA采样的澳大利亚海狮的基因多样性（等位基因杂合的概率）水平（HE= 0.20–0.22）明显高于WA的个体（HE= 0.02–0.07）。来自阿布罗柳斯的个体杂合比例最低（HO= 0.02），而来自南斯宾塞湾的个体最高（HO= 0.20），是阿布罗柳斯的10倍。Seal Bay的种群水平近交系数最高（FIS= 0.27），紧随其后的是阿布罗柳斯（FIS= 0.23），表明这些种群内的交配不是随机的，而朱里恩湾接近零（所有种群中最低水平；FIS= 0.06）。
4 Discussion
在本研究中，我们评估了该物种最西北繁殖地——豪特曼阿布罗柳斯群岛的澳大利亚海狮的遗传连通性，该地曾暴露于历史和当前的威胁之下。阿布罗柳斯种群在遗传上与该海狮分布范围内其他已研究的种群（包括WA内的种群）相隔离，并且被发现具有非常低的遗传多样性水平。鉴于澳大利亚海狮特殊的陆海需求、出生地忠诚度以及气候变化日益增强的影响，阿布罗柳斯种群的长期生存前景不确定，需要采取与物种范围内其他种群不同的管理策略。
我们的研究结果清楚地表明，西海岸WA的澳大利亚海狮种群与SA的种群是不同的。重要的是，阿布罗柳斯与其最近的朱里恩湾种群是不同的。这表明尽管相距仅200公里，但动物在这两个种群之间的迁移受到限制。基于1989年和1999年收集的mtDNA，一个单一的母系将阿布罗柳斯和朱里恩湾的幼崽联系起来。这表明两个种群都是同一批雌性的后代。预测使用双亲遗传
