活性污泥中Variovorax与Acidovorax菌株协同矿化香料成分2-环己亚基-2-苯基乙腈的机制研究

《Environmental Microbiology Reports》：Cooperative Mineralisation of the Fragrance Ingredient 2-Cyclohexylidene-2-Phenylacetonitrile by a Consortium of a Variovorax and an Acidovorax Strain Isolated From Activated Sludge

本文首次揭示了香料成分Peonile（2-环己亚基-2-苯基乙腈）在标准OECD 301测试中虽未通过快速生物降解性筛选，但可通过活性污泥中分离的Variovorax与Acidovorax菌株的协同作用实现完全矿化。研究通过代谢途径解析（如苯环开环生成2CCHA中间体）和双相矿化曲线验证，为复杂有机物在环境中的终极生物降解性评估提供了重要案例。

　　

ABSTRACT

为评估物质的终极生物降解性（Ultimate Biodegradability），通常要求其在筛选测试中达到≥60%的矿化率。本研究以香料成分2-环己亚基-2-苯基乙腈（Peonile）为对象，其结构虽含可生物降解的苯环和环己烷片段，且缺乏典型难降解基团（如高度烷基分支或季碳原子），但未能通过OECD 301F快速生物降解测试。通过长期富集培养，从活性污泥中分离出两株Acidovorax菌（Peo-1B-1-6和Peo-V-1-1）和一株Variovorax菌（Peo-22-4）。Acidovorax菌可降解Peonile的苯环，生成稳定代谢物2-氰基-2-环己亚基乙酸（2CCHA），而Variovorax菌专性降解2CCHA。双菌联合实验表明，其在OECD 301D和301F条件下可实现Peonile的完全矿化（60%~72%矿化率）。双相矿化曲线揭示了协同代谢的必要性，证明Peonile具备由污水污泥微生物介导的终极生物降解潜力。

1 Introduction

终极生物降解指微生物将有机物完全矿化为CO₂的过程，相较于仅涉及母化合物结构变化的初级降解（Primary Biodegradation），其环境相关性更强。根据OECD 301指南，物质需在28天内达到≥60%的理论耗氧量或CO_{2>生成量方可被认定为“终极可降解”。然而，标准测试的高底物浓度与低接种量条件可能不适用于依赖多菌协同代谢的底物。例如，除草剂敌草隆（Diuron）和阿特拉津（Atrazine）的降解需依赖多种菌的分步代谢。}

Peonile作为香料成分，其结构缺乏难降解特征，却未通过OECD 301F测试。本研究通过富集培养和菌株分离，首次证实其可通过Acidovorax与Variovorax的联合作用实现矿化，为污水污泥中微生物协同代谢外源物（Xenobiotic）提供了新案例。

2 Materials and Methods

2.1 Chemicals

Peonile由Givaudan Switzerland SA提供。代谢物2CCHA通过环己酮与氰基乙酸在甲苯中回流缩合合成（收率56%），其结构经核磁共振（¹H NMR、¹³C NMR）和液相色谱-质谱（LC-MS）验证。

2.2 污泥富集与菌株分离

从瑞士Bois-de-Bay污水处理厂获取活性污泥，经三次28天周期的Peonile富集培养（底物浓度30 mg/L）后，细菌数量从10⁵CFU/mL升至1.3×10⁷CFU/mL。通过平板分离和16S rRNA测序鉴定菌株。

2.3 矿化实验

采用OECD 301D（微量耗氧测定）和301F（OxiTop呼吸仪）方法，评估单一菌株及联合菌群对Peonile的矿化能力。底物浓度通过气相色谱（GC-FID）校准以避免挥发损失。

2.4 代谢物分析

通过高分辨质谱（HR LC-MS）监测降解过程中间体，离子化模式为电喷雾离子化（ESI），碰撞能量为35 eV。

3 Results

3.1 富集污泥的矿化特征

适应污泥在OECD 301D条件下对Peonile的矿化呈双相曲线：前3天快速耗氧（对应苯环降解），随后进入平台期，最终在27天达到70%矿化率（图1）。该现象提示降解过程依赖多步代谢。

3.2 菌株功能鉴定

Acidovorax菌（Peo-1B-1-6和Peo-V-1-1）在14天内完全降解Peonile，积累代谢物2CCHA（分子量165.08 Da）。合成2CCHA的质谱特征与菌株产物一致（图3）。Variovorax菌（Peo-22-4）专一性降解2CCHA，但对Peonile无活性。

3.3 协同降解验证

双菌联合培养（如Peo-1B-1-6 + Peo-22-4）在1小时内即可完全去除Peonile，且无2CCHA积累（表1）。单独Acidovorax菌在OECD 301F测试中矿化率停滞于28%~36%，而双菌组合在28天达到60%以上矿化（图5）。

3.4 代谢途径解析

Acidovorax菌降解Peonile时，5分钟内即检测到儿茶酚中间体（M1，C₁₄H₁₅NO₂），随后通过间位开环（Meta-cleavage Pathway）生成2CCHA（图6）。Variovorax菌降解2CCHA时未检测到显著中间体，表明其代谢速率极快。

4 Discussion

本研究证实Peonile的终极生物降解性依赖Acidovorax与Variovorax的协同作用，其双相矿化曲线反映了分步代谢的动力学差异。与土壤中农药降解菌群不同，这是首例从污水处理厂污泥中直接分离并证实协同代谢特定外源物的研究。标准OECD测试的低接种量条件可能不足以支持多菌协同，导致假阴性结果。未来需进一步探究污泥微生物群落中协同代谢的普遍性及环境意义。