《The FEBS Journal》：Selective targeting of cortactin tandem repeat acetylation by human lysine deacetylases
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本文通过遗传密码扩展技术，首次在体外重构系统中系统评估了人源赖氨酸去乙酰化酶（KDACs）对皮质蛋白（CTTN）串联重复区7个特定位点乙酰化变体的去乙酰化活性。研究发现HDAC6主要通过其第二催化结构域（DD2）高效去乙酰化所有测试位点，而SIRT1和SIRT2以NAD+依赖性方式作用于重叠位点，其他锌依赖性HDACs（如HDAC8）活性微弱。该研究为解析KDACs的底物选择性及细胞骨架动态调控提供了生化机制新见解。
引言
皮质蛋白（Cortactin, CTTN）作为一种肌动蛋白结合蛋白，在细胞骨架重塑、癌细胞迁移和神经元发育中发挥关键作用。其串联重复区域内的赖氨酸乙酰化状态直接调控与F-肌动蛋白的结合能力：乙酰化模拟突变（K→Q）削弱结合，而去乙酰化模拟突变（K→R）增强结合。尽管多项细胞研究提示HDAC6、SIRT1等KDACs可能参与CTTN去乙酰化，但其直接酶活性和位点特异性尚不明确。
蛋白变体的制备与表征
研究团队通过遗传密码扩展技术，在大肠杆菌中成功表达并纯化了7种位点特异性乙酰化的全长人CTTN变体（AcK87、AcK124、AcK161、AcK198、AcK235、AcK272、AcK309）。蛋白质通过双步亲和色谱纯化，分析超速离心证实其单分散性和正确折叠。乙酰化位点通过质谱验证，且乙酰化信号仅在培养基中添加Nε-乙酰赖氨酸（AcK）时出现，证明位点特异性修饰的成功引入。
HDACs 1–11对AcK-CTTN的去乙酰化筛选
在包含HDACs 1–11的初步筛选中，仅有HDAC6能显著降低所有测试AcK-CTTN变体的乙酰化水平。其他锌依赖性HDACs（包括曾被细胞研究提示有活性的HDAC8）在体外条件下未显示明显活性。HDAC6对不同位点的去乙酰化效率存在差异，如AcK161在30分钟内完全去乙酰化，而其他位点需更长时间。
HDAC6、HDAC8、SIRT1和SIRT2的精细活性分析
进一步研究显示，HDAC6在等摩尔酶浓度下可完全去乙酰化所有7个位点。SIRT1和SIRT2能以NAD+依赖性方式去乙酰化CTTN，其中SIRT1活性高于SIRT2，但均低于HDAC6。SIRT2的活性可被烟酰胺（NAM）抑制，证实其酶促特异性。HDAC8仅在极高浓度和长时间孵育下对部分位点（如AcK124、AcK235）表现出微弱活性。
肽段水平去乙酰化活性的对比
通过合成13-mer乙酰化肽段（对应CTTN串联重复序列），研究发现HDAC6对肽段的去乙酰化效率最高，其KM值为62–120 μM。HDAC8在肽段水平呈现低活性（约HDAC6的10–15%），而HDAC1–3几乎无活性。值得注意的是，肽段实验结果需谨慎解读，因酶活受蛋白结构上下文影响显著。
HDAC6催化结构域的功能定位
通过催化失活突变体（H216A-DD1失活、H611A-DD2失活）验证，HDAC6对CTTN的去乙酰化功能完全依赖于其第二催化结构域（DD2），而DD1结构域无贡献。这一发现与部分细胞研究中“双结构域共同作用”的结论不同，提示细胞环境可能通过间接机制调控DD1功能。
讨论与结论
本研究首次在完全重构的体外系统中明确了HDAC6是CTTN串联重复区的主要去乙酰化酶，且其DD2结构域起主导作用。SIRT1和SIRT2作为直接去乙酰化酶的活性得到证实，但HDAC8的直接作用有限。研究强调了生化重构在解析酶-底物关系中的重要性，同时指出细胞内的乙酰化调控可能受蛋白构象、互作因子及翻译后修饰网络的影响。该工作为靶向CTTN-KDAC轴调控细胞运动性疾病（如癌症转移）提供了精准的分子基础。
