《FASEB BioAdvances》：Effect of Denervation on Skeletal Muscle Mitochondria in Heterozygous mtDNA Mutator Mice
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本研究探讨了在部分DNA聚合酶γ（PolG）校对功能缺陷的杂合mtDNA突变（PolG(+/mut)）小鼠模型中，去神经支配对骨骼肌线粒体的影响。通过14天去神经模型，文章揭示了尽管肌肉湿重和线粒体酶活性显著降低，但未观察到基因型特异性肌肉萎缩差异。PolG(+/mut)小鼠表现出更紊乱的线粒体嵴结构和升高的氧化应激标志物，提示其线粒体更脆弱。研究强调了在mtDNA不稳定性条件下，增强的抗氧化反应（如过氧化氢酶表达上调）对于维持线粒体完整性的潜在重要性，为理解肌肉萎缩中的线粒体适应性提供了新视角。
1 引言
骨骼肌是人体最大的组织，约占去脂体重的40%。它不仅是运动的关键器官，也是葡萄糖和脂质代谢的主要场所，与能量稳态密切相关，并与糖尿病和代谢综合征等疾病有密切联系。骨骼肌具有显著的可塑性，能够对机械负荷和卸载做出反应。例如，抗阻运动通过机械刺激促进肌肉肥大，而卧床休息或肢体固定则导致肌肉萎缩。此外，耐力运动能增加线粒体含量和氧化酶活性，促进慢肌纤维转化，增强耐力。因此，骨骼肌适应各种刺激的能力对于维持积极健康的生活方式至关重要。
线粒体作为关键的细胞内细胞器，深刻影响肌肉可塑性。在肌肉收缩过程中，它们产生大量所需能量。这些细胞器在骨骼肌中形成网络以优化能量供应。ATP是细胞的主要能量来源，通过线粒体内膜呼吸链复合物中的氧化磷酸化产生。线粒体功能受损会减少能量生产，导致骨骼肌功能障碍和萎缩。例如，特异性敲除骨骼肌中线粒体生物发生的主调控因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α（PGC-1α），会减少线粒体含量和肌纤维横截面积。此外，线粒体疾病患者常因线粒体功能受损而出现肌无力和运动诱发性痉挛。与年轻人相比，老年人骨骼肌中的线粒体数量和质量也有所下降，这有助于肌少症的发生。因此，维持或增强线粒体数量和质量对于保持骨骼肌质量和功能至关重要。
线粒体通过融合和分裂过程不断重构，这一过程统称为线粒体动力学。融合通常提高能量生产效率，而分裂则通过自噬实现受损线粒体的清除。通过这些动力学，线粒体通过相互交换mtDNA和基因产物来维持功能。在结构上，mtDNA与核DNA不同，呈双环状，编码13个呼吸链复合物亚基、22个转运RNA（tRNA）和2个核糖体RNA（rRNA），共37个基因。线粒体独特地受核DNA和mtDNA共同控制。与核DNA不同，mtDNA缺乏保护性的核膜，使其更容易受到线粒体环境的影响。在ATP产生过程中，会产生活性氧（ROS），可能损伤mtDNA。ROS诱导的mtDNA损伤可能导致突变或缺失，损害线粒体功能并影响各种器官和组织。积累的mtDNA突变与骨骼肌功能障碍相关。
PolG(mut/mut)小鼠缺乏聚合酶γ（PolG）的校对能力，该酶对mtDNA复制和修复至关重要，因此比野生型小鼠更快地积累随机mtDNA突变。由于PolG定位于线粒体内并直接参与mtDNA复制，它极易受到活性氧（包括过氧化氢）的氧化损伤。PolG的氧化修饰可能导致DNA复制和修复受损，引起线粒体基因组完整性的进行性下降。此外，PolG的氧化失活可能引发线粒体功能障碍的级联反应，其中减少的mtDNA复制损害ATP生产，加剧氧化应激并进一步损害细胞稳态。因此，这些小鼠表现出加速衰老的表型，如3月龄时出现脊柱后凸、毛发灰白、耐力下降和肌肉萎缩。在PolG(mut/mut)骨骼肌中，氧化应激水平随着肌肉萎缩而升高，表明氧化应激诱导的mtDNA突变导致了这种萎缩。PolG(+/mut)小鼠仅在一个染色体上携带突变，由于完整PolG基因的代偿性校对作用，积累的mtDNA突变较少。因此，这些小鼠通常不表现出PolG(mut/mut)小鼠中所见的早衰表型，即使存在mtDNA突变。最近的研究利用PolG(+/mut)小鼠来研究部分mtDNA突变对生理学的影响。PolG(+/mut)小鼠提供了一个生理相关模型，用于研究中度mtDNA突变积累，而没有PolG(mut/mut)小鼠中出现的严重系统性退化。虽然PolG(mut/mut)小鼠表现出早衰和快速的肌肉退化，但PolG(+/mut)小鼠维持正常寿命并以较慢的速度积累mtDNA突变。该模型已被用于研究生理条件下的线粒体质量控制和氧化应激反应。通过使用PolG(+/mut)小鼠，我们旨在评估中度mtDNA突变负荷如何影响去神经诱导肌肉萎缩过程中的线粒体动力学和氧化应激。然而，mtDNA突变对萎缩诱导的线粒体适应的影响尚不清楚。
为了阐明mtDNA突变在肌肉萎缩中的作用，我们使用了易发生mtDNA突变的PolG突变小鼠，并让它们接受肌肉萎缩的去神经模型。选择该模型是因为它能够复制神经肌肉功能障碍，这与肌少症和周围神经病变等相关，其中神经肌肉传递受损导致肌肉萎缩。与固定或后肢悬吊模型不同，去神经专门分离了神经肌肉断开对线粒体功能的影响。此外，单侧去神经使每只动物可以作为自身的对照，最大限度地减少个体间差异，并为研究在中度mtDNA突变负荷背景下线粒体对去神经的反应提供了一个框架。我们假设PolG(+/mut)小鼠的去神经会导致更明显的肌肉萎缩，因为其mtDNA突变积累速率高于WT小鼠。
2 材料与方法
2.1 动物
近交系B6J雄性小鼠通过兄妹交配超过40代获得。具有相同B6J核遗传背景的mtDNA突变小鼠按先前描述的方法产生。动物饲养在空调设施中，光暗周期12:12，自由获取标准饲料和水。基因分型确定小鼠的遗传背景，分为两组：WT（PolG(+/+)）和PolG(+/mut)（每组n=6）。由于肌肉样本降解，Western blot分析每组n=5进行。本研究中使用的所有小鼠均为雄性，年龄在10至12周之间。
2.2 基因分型
使用PCR进行基因分型。在4周龄时，从PolG(+/mut)杂交小鼠的尾尖提取基因组DNA。使用所列引物扩增提取的DNA，并用限制性内切酶处理1小时。样品然后在1.5% TAE凝胶上电泳。图1A显示了每种基因型的代表性条带模式。
2.3 去神经
所有小鼠均接受单侧坐骨神经横断手术。用异氟烷麻醉小鼠，在后左后肢做一个小切口，在股骨转子水平暴露坐骨神经。使用小手术剪刀切除至少5.0毫米的坐骨神经段，皮肤用手术胶水闭合。右后肢作为假手术对照。手术后14天，通过颈椎脱臼法处死小鼠。这个时间段允许我们观察氧化应激反应和线粒体适应，而不会因广泛的肌肉组织降解而使结果解释复杂化。然后取出肌肉组织，称重，快速冷冻在液氮中，并储存在-80°C直至各项分析。
2.4 CS和COX酶活性
在整块趾长伸肌匀浆中测量柠檬酸合酶（CS）和细胞色素c氧化酶（COX）的最大活性。将肌肉部分在100体积/重量的100 mmol/L磷酸钾缓冲液中匀浆。对于CS酶活性，将等分试样与反应混合物在96孔微孔板中混合。在412 nm/min测量吸光度变化。对于COX酶活性，将等分试样与反应混合物在96孔微孔板中混合。在550 nm/min测量吸光度变化。CS和COX活性使用Takahashi等人描述的方法通过分光光度法测定。
2.5 蛋白质印迹法
将取出的腓肠肌的一半立即在液氮中冷冻，并使用含有完全蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液提取总肌肉蛋白。使用蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。在SDS-PAGE之前，将提取的蛋白质溶液等分试样与等体积的含有1%（体积/体积）2-巯基乙醇的样品上样缓冲液混合。将混合物在37°C加热30分钟。然后，将10 μg蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到PVDF膜上。将印迹在室温下用封闭剂封闭1小时，然后在4°C下与一抗在含0.1% Tween-20的TBS中孵育过夜。然后将膜在室温下与二抗孵育1小时。使用化学发光底物检测信号，用成像系统量化并以任意单位表示。使用考马斯亮蓝染色确认上样一致性。
2.6 蛋白质印迹一抗
用于蛋白质印迹的一抗包括：PGC-1α、细胞色素C、氧化磷酸化（OXPHOS）复合物亚基（NDUFB8、SDHB、UQCRC2、ATP5A）、线粒体融合蛋白2（MFN2）、视神经萎缩蛋白1（OPA1）、动力相关蛋白1（DRP1）、磷酸化DRP1、线粒体裂变蛋白1（FIS1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、泛素化结合蛋白、磷酸化FoxO1、总FoxO1、肌肉环指蛋白1（MuRF1）、肌肉萎缩F框（MAFbx）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）、 sequestosome 1 （p62/SQSTM1）、E3泛素蛋白连接酶帕金（Parkin）、Bcl-2/E1B-19 kDa相互作用蛋白3（Bnip3）、4-羟基壬烯醛（4-HNE）、血红素加氧酶1（HO-1）和过氧化氢酶（Catalase）。
2.7 RNA提取与实时定量PCR
使用TRIzol试剂从冷冻的腓肠肌中提取总RNA。使用微量分光光度计确认RNA的数量和质量。使用逆转录试剂盒合成互补DNA。使用SYBR Green在实时PCR系统上进行定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）。PCR方案包括在95°C变性15秒，然后在60°C退火和延伸40秒（40个循环）。分析解离曲线以验证每个反应的特异性。使用标准曲线法确定相对mRNA表达水平，并归一化到TATA框结合蛋白（Tbp）的表达。引物序列列于表中。
2.8 mtDNA拷贝数
mtDNA拷贝数的测量按先前描述的方法进行。使用Nd1（编码于mtDNA）和Ucp2（编码于核DNA）的基因表达水平进行相对线粒体DNA（mtDNA）拷贝数定量。引物序列也列于表中。
2.9 透射电子显微镜成像
将趾长伸肌在4°C下于2%戊二醛和2.5%甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液（PB）中预固定24小时，然后在0.1 mol/L PB中洗涤三次，每次15分钟。然后将样品在4°C下于1%四氧化锇中固定2小时，轻轻摇晃，然后在梯度乙醇系列（50%、70%、80%、95%和100%）中于25°C脱水。脱水后，样品在25°C下用环氧丙烷渗透三次，每次20分钟，并在60°C下包埋在树脂中48小时。使用超薄切片机上的金刚石刀切割超薄切片，附着在覆有支持膜的铜网上。用醋酸铀酰和柠檬酸铅对切片进行染色，并使用透射电子显微镜成像。
2.10 统计分析
使用统计软件分析数据，数据以平均值±标准差（SD）表示，并显示个体值。配对数据用线连接。使用t检验和双因素方差分析进行统计分析，当获得显著p值时，使用Tukey方法进行事后检验。统计学显著性设定为p < 0.05。
3 结果
去神经显著降低了两种基因型小鼠所检查的三块肌肉——比目鱼肌、趾长伸肌和腓肠肌——的湿重（图1C–E）。WT和PolG(+/mut)小鼠之间的体重没有显著差异（图1B）。双因素方差分析显示，去神经对比目鱼肌（p < 0.0001）、趾长伸肌（p < 0.0001）和腓肠肌（p < 0.0001）有显著的主效应，但在比目鱼肌（p = 0.5627）和腓肠肌（p = 0.7174）中未观察到显著的基因型或交互效应。然而，在趾长伸肌中观察到显著的基因型效应（p = 0.0231），表明PolG(+/mut)小鼠的肌肉质量低于WT，但未检测到去神经与基因型之间的显著交互作用（p = 0.3397）。通过CS和COX活性评估的线粒体含量也受到去神经的影响（图1F,G）。CS活性显示出显著的去神经主效应（p = 0.0013），没有显著的基因型效应（p = 0.1686）或交互作用（p = 0.9693）。同样，COX活性没有显示出显著的去神经主效应（p = 0.0897），也没有显著的基因型（p = 0.6300）或交互效应（p = 0.5853）。
在WT假手术组中，线粒体显示出典型的结构，具有良好组织的嵴和完整的膜，反映了正常的线粒体功能（图2A）。然而，去神经后，WT小鼠表现出一些线粒体异常，包括线粒体肿胀和轻微的嵴紊乱，提示去神经诱导的线粒体损伤的早期迹象（图2B）。在PolG(+/mut)假手术组中（图2C），线粒体大体正常，但观察到偶尔的不规则性，可能是由于PolG突变所致。在PolG(+/mut)小鼠去神经后，观察到更严重的线粒体异常，包括明显的嵴紊乱和广泛肿胀（图2D）。这些发现表明，与WT小鼠相比，PolG(+/mut)小鼠去神经后线粒体结构改变更为明显，这可能与线粒体完整性改变有关。
评估了去神经对野生型（WT）和PolG(+/mut)小鼠线粒体DNA（mtDNA）拷贝数和mtDNA编码基因表达的影响（图3）。评估了去神经后野生型（WT）和PolG(+/mut)小鼠中线粒体含量相关蛋白（即氧化磷酸化（OXPHOS）和PGC-1α）的表达水平（图3）。去神经显著降低了几种线粒体标志物的蛋白表达水平（图3A–H）。双因素方差分析显示，去神经对PGC-1α（p = 0.0008）和细胞色素C（p < 0.0001）有显著的主效应（图3B,C），表明线粒体含量和功能受损。然而，未观察到这些标志物的基因型特异性效应或交互作用。关于OXPHOS相关蛋白，去神经对NDUFB8（p = 0.0948）、SDHB（p = 0.0005）、UQCRC2（p < 0.0001）、MTCO1（p = 0.0012）和ATP5A（p = 0.0294）有显著的主效应（图3D–H），未检测到基因型特异性效应或交互作用。
去神经显著降低了两种基因型的mtDNA拷贝数（图3I）。事后分析证实，去神经的PolG(+/mut)小鼠的mtDNA拷贝数显著低于去神经的WT小鼠（p = 0.0060）。线粒体相关基因的mRNA表达同样受到去神经的影响，导致Pgc-1α（p = 0.0215）、Tfam（p = 0.0045）、Cs（p = 0.0111）和Cox4（p = 0.0039）显著降低（图3J–M）。未发现这些基因有显著的基因型或交互效应。总体而言，数据表明去神经诱导线粒体含量和功能显著下降，这通过关键线粒体蛋白和mRNA水平的下调得以体现。这种线粒体功能障碍在WT和PolG(+/mut)小鼠中相似地发生。双因素方差分析显示去神经（p = 0.0024）和基因型（p = 0.0318）有显著的主效应，并且去神经与基因型之间存在显著的交互作用（p = 0.0174）。还测量了mtDNA编码基因（Nd1、Nd4、Cox1和Cox2）的表达水平（图3N–Q）。去神经显著降低了Nd1（p = 0.0434）、Nd4（p = 0.0107）、Cox1（p = 0.0016）和Cox2（p = 0.0049）的表达，但未观察到这些基因有显著的基因型主效应或交互作用（图3N–Q）。
通过检查与线粒体裂变和融合相关的蛋白和mRNA表达，评估了去神经对线粒体动力学的影响。线粒体动力学标志物的蛋白表达：去神经显著影响了参与这些过程的蛋白的表达（图4A–E）。双因素方差分析显示，磷酸化DRP1增加（p = 0.0002），MFN2响应去神经而减少（p = 0.0153）。未观察到显著的基因型特异性效应或交互作用。此外，FIS1和OPA1的表达没有显著差异（图4B–E）。线粒体动力学基因的mRNA表达：与线粒体裂变和融合相关的基因的mRNA水平遵循与蛋白表达相似的趋势（图4F–J）。去神经显著增加了Drp1mRNA水平（p = 0.0371）（图5G），而Mfn1（p = 0.0076）、Mfn2（p = 0.0368）和Opa1（p = 0.0343）显著降低，表明线粒体裂变上调而融合下调。未发现任何线粒体动力学相关基因有显著的基因型或交互效应（图4G–J）。这些结果表明，去神经促进了线粒体裂变，同时抑制了融合，这与线粒体碎片化一致。缺乏显著的基因型效应意味着这些变化在WT和PolG(+/mut)小鼠中相似地发生。
我们量化了去神经期间肌肉损伤的关键因素——氧化应激。评估了去神经对WT和PolG(+/mut)小鼠氧化应激和抗氧化蛋白的影响，揭示了几种标志物的显著改变。
检查了氧化应激标志物的蛋白表达。去神经显著增加了过氧化氢酶的表达（p < 0.0001），并且去神经与基因型之间存在显著的交互作用（p = 0.0126）。事后分析证实，去神经的PolG(+/mut)肌肉中的过氧化氢酶表达显著高于去神经的WT肌肉（p = 0.0060）。然而，未观察到HO-1和4-HNE有显著的基因型效应，尽管去神经对4-HNE水平产生了主效应（p = 0.0030）（图5B,D）。
Ho-1和catalase的mRNA水平因去神经而显著升高（分别为p = 0.0154和p = 0.0004），并且这两个基因都存在显著的交互作用（分别为p = 0.0305和p = 0.0492
