《Neurobiology of Disease》：Novel extracellular vesicle release pathway facilitated by toxic superoxide dismutase 1 oligomers
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本研究针对ALS疾病传播机制不清的问题，通过稳定SOD1三聚体，发现其通过调控VAPB、VCP和Stathmin-2等关键蛋白在EVs上的富集，并揭示了一条涉及Caveolae内吞的新型混合EVs释放途径。研究结合抑制剂筛选、Co-IP质谱分析和蛋白质组学，证实毒性SOD1三聚体通过改变囊泡货物成分和释放通路促进疾病扩散，为ALS的早期诊断和治疗提供了新靶点。
在神经退行性疾病的研究领域，肌萎缩侧索硬化（ALS）始终是一个令人困惑的难题。这种致命的疾病在确诊后三到五年内就会导致患者瘫痪甚至死亡，但其发病机制却像一团迷雾。科学家们已经发现超过40种不同蛋白质的突变与ALS相关，这引发了一个根本性的争论：ALS究竟是一种单一疾病，还是多种具有相似症状的疾病集合？更令人费解的是，疾病是如何在神经系统中一步步扩散的？尽管只有2-3%的ALS病例与Cu,Zn超氧化物歧化酶1（SOD1）的突变直接相关，但错误折叠的SOD1蛋白却同时出现在散发性和家族性ALS患者中。近年来，细胞外囊泡（EVs）——这些细胞释放的微小膜泡——被认为是疾病传播的关键载体，然而其中的具体分子机制仍然是个黑箱。
正是在这样的背景下，Brianna Hnath等人的研究团队将目光投向了SOD1的一种特殊形式——毒性三聚体。此前的研究表明，小而可溶的SOD1三聚体比大的不溶性聚集体具有更高的毒性，可能是导致疾病的关键因素。研究人员提出了一个大胆的假设：这些毒性三聚体是否通过EVs在细胞间传播，并像指挥家一样影响其他ALS相关蛋白的分布，从而揭示出一种共通的疾病传播机制？为了验证这一猜想，他们在发表于《Neurobiology of Disease》上的研究中进行了一系列精巧的实验。
研究者主要运用了几项关键技术：首先，他们利用稳定SOD1三聚体的突变体（如FH突变体），在运动神经元样NSC-34细胞中建立模型；其次，通过超速离心法分离EVs，并结合抗CD9抗体的 sandwich ELISA（酶联免疫吸附试验）技术特异性捕获和分析CD9阳性EVs表面蛋白的变化；再者，采用一组针对不同内吞和外排途径的抑制剂进行通路筛选；最后，通过免疫共沉淀结合质谱分析（Co-IP MS）来鉴定与关键蛋白相互作用的蛋白质组变化。
2.1. Trimeric SOD1 stabilization increases misfolded SOD1 on the surface of EVs
研究首先证实，通过引入能稳定SOD1三聚体构象的突变（如FH双突变），可以显著增加CD9阳性EVs表面被C4F6抗体识别的错误折叠SOD1的水平。与野生型（WT）或常见致病突变A4V相比，FH突变体导致EVs上的错误折叠SOD1浓度呈现递增式上升，这表明他们成功建立了一个能够特异性研究三聚体SOD1对EVs影响的系统。
2.2. ALS-associated proteins increase and decrease on EVs with trimeric SOD1 stabilization
接下来，研究人员检测了17种ALS相关蛋白在EVs上的变化。结果发现，随着SOD1三聚体的稳定，VAPB（囊泡相关膜蛋白相关蛋白B）、VCP（含缬酪肽蛋白）和Stathmin-2（Stathmin-2）在EVs上的水平显著增加，而SPG11（Spatacsin）的水平则下降。这表明SOD1三聚体并非孤立作用，而是能够主动改变EVs的货物组成，特异性地影响一组与囊泡运输、内质网功能和微管动力学相关的关键蛋白。
2.3. Isolating the mechanism of release of altered EVs
为了阐明这些改变的EVs是如何被释放的，研究团队从三个层面进行了深入探索。首先，他们使用了一系列针对不同内吞和外排途径的抑制剂。有趣的是，抑制巨饮作用（macropinocytosis）的抑制剂EIPA反而导致VAPB、VCP和Stathmin-2在EVs上的水平进一步升高，而抑制小窝蛋白（Caveolin-1）介导的内吞作用的抑制剂Genistein则降低了这些蛋白的水平。这提示，SOD1三聚体可能影响了囊泡的循环和释放平衡。其次，通过Co-IP质谱分析，他们发现与WT相比，在FH突变背景下，与VAPB、VCP或Stathmin-2相互作用的蛋白质组发生了显著变化，新出现了一批与内质网-高尔基体运输、蛋白质折叠、染色质重塑和应激反应相关的蛋白，如RFC2、PARP1、eIF6、UBE2G2等，这些蛋白许多与小窝蛋白1的功能域相关联。最后，对22个EV相关蛋白的筛查显示，SOD1三聚体稳定化特异性地导致EVs上的RIM2（Rab3相互作用分子2）减少，而Caveolin-1和Cavin-1（小窝蛋白1的重要搭档）增加。在细胞内部，天然蛋白质印迹（Western blot）分析进一步揭示，三聚体SOD1导致Caveolin-1寡聚体增加，而Cavin-1寡聚体减少，二者呈现强烈的负相关，表明三聚体SOD1破坏了正常的小窝结构形成。
综合以上结果，本研究得出结论：毒性SOD1三聚体通过破坏Caveolin-1/Cavin-1介导的膜域组织和囊泡运输通路，改变了一系列关键ALS相关蛋白（如VAPB、VCP、Stathmin-2）在EVs上的装载和释放。这揭示了一条以前未被认识的、混合了内吞和外排特征的EVs释放新途径，该途径在ALS的疾病传播中可能扮演了核心角色。
在讨论部分，作者强调了此项研究的多重意义。在理论层面，它将不同ALS相关蛋白通过SOD1三聚体和EVs释放通路联系起来，为理解这种复杂疾病提供了一个可能的统一机制框架。在应用层面，发现VAPB、VCP、Stathmin-2等蛋白在EVs上的特异性变化，为开发基于血液或其他体液的ALS早期诊断生物标志物带来了希望。更重要的是，识别出Caveolae通路作为关键环节，为干预疾病扩散提供了新的潜在治疗靶点。例如，调节Caveolin-1的功能或相关通路可能有助于阻止毒性蛋白的传播。总之，这项研究不仅深化了对ALS病理机制的理解，也为未来攻克这一顽疾开辟了新的方向和思路。
