《Postharvest Biology and Technology》：Senescence-associated NAC transcription factor OfNAC92 accelerates floral aroma decline by repressing
OfCCD1 in harvested
Osmanthus fragrans flowers
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通过酵母双杂交筛选鉴定到NAC转录因子OfNAC92，其直接结合OsCCD1启动子中的CACG元件并抑制其表达，导致β-离子酮合成减少，加速采后花香衰减。该研究为调控花卉香气持久性的分子机制提供了新见解。
王嘉欣|张明珠|叶云芳|张春玲|史婷婷|杨秀莲|王良桂|岳元正
中国南京林业大学树木遗传与育种国家重点实验室，南京 210037
摘要
花香是Osmanthus fragrans重要的观赏性和经济性特征。然而，采收后的花朵花香会迅速消退，主要是由于类胡萝卜素衍生的挥发性化合物β-ionone的含量减少。这一过程的调控机制尚不清楚。在本研究中，我们利用OfCCD1启动子作为诱饵，通过酵母单杂交（Y1H）筛选技术鉴定出一个与衰老相关的NAC转录因子OfNAC92。我们发现，在采收后的甜桂花衰老过程中，OfNAC92的表达显著增强，并且与β-ionone合成基因OfCCD1的转录水平及β-ionone的积累呈负相关。通过启动子截短、酵母单杂交、电泳迁移率变化和双荧光素酶报告基因实验，我们证明OfNAC92可以直接结合到OfCCD1启动子增强子区域的NAC cis-元件（CACG）上并抑制其转录。在甜桂花中过表达OfNAC92或使用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术进一步证实，OfNAC92能够负调控β-ionone的生物合成。总体而言，我们的研究结果表明，与衰老相关的OfNAC92通过直接抑制OfCCD1来加速采收后O. fragrans花朵香气的衰退。这项研究为花香持久性的转录调控提供了重要见解，并为采收后观赏性花卉的遗传改良提供了一个潜在靶点。
引言
Osmanthus fragrans属于木犀科，是一种重要的常绿观赏灌木或小乔木，因其芳香且甜美的花香而备受青睐。它广泛用于亚洲、北美和欧洲的亚热带景观绿化（Chen等人，2021年；Tong等人，2018年）。O. fragrans的新鲜花朵可作为食品、茶叶和香水的天然功能性香料添加剂（Hu等人，2010年；Wang等人，2009年）。然而，由于其花朵在采收后香味迅速减弱，其切花的商业和观赏价值大大降低。此外，甜桂花的花期较短，最佳采收窗口也很狭窄（Zou等人，2014年）。因此，了解花朵衰老过程中香味丧失的分子机制对于提高切花品质至关重要。
花香对观赏性花卉的美学和经济价值有着重要影响。β-ionone是一种重要的挥发性有机化合物（VOC），决定了O. fragrans的花香质量（Huang等人，2025b年；Meng等人，2024年）。这种VOC主要通过类胡萝卜素裂解途径合成，该途径由类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD）催化（Qi等人，2022年）。目前，已在多种植物物种中鉴定出参与β-ionone生物合成的CCD，例如Dendrobium officinale中的DoCCD1（Wang等人，2022年）、Petunia hybrida中的PhCCD1（Simkin等人，2004年）和Camellia sinensis中的CsCCD4（Wang等人，2020a年）。最近，CCD的转录调控机制也得到了越来越多的研究。例如，在Citrus sinensis中，转录因子CsMADS6和CsERF061可以分别结合到CsCCD1启动子中的CArG盒和GCC盒，从而增强其活性并促进类胡萝卜素代谢（Lu等人，2018年；Zhu等人，2021年）。在O. fragrans中，OfERF2可以直接结合到OfCCD4启动子中的AP2/ERF转录因子结合元件，调节开花期β-ionone的合成（Han等人，2022年）。然而，调控CCD在花朵衰老期间表达的具体机制仍不清楚。
启动子截短实验可以识别出负责启动子活性的核心区域（Kummari等人，2020年）。最近的研究表明，在这些核心区域内，转录因子可以通过结合相应的cis-元件来调控基因表达。例如，在Paeonia lactiflora中，对萜烯合成基因PlTPS1启动子的截短分析发现了一个包含MYB cis-元件的核心区域，这些元件直接被MYB家族转录因子PlMYB108和PlMYB70结合，从而促进芳樟醇的合成（Zhao等人，2025年）。同样，在Solanum commersonii中，ScF3′H启动子中的一个284 bp区域对冷胁迫反应至关重要，WRKY转录因子ScWRKY41可以直接结合到该区域中的W-box cis-元件，从而增强抗冻性（Bao等人，2025年）。
NAC转录因子家族是最大的植物特异性转录因子家族之一。其成员具有保守的N端NAC结构域和多样的C端转录调控区域（Puranik等人，2012年）。已有研究表明，NAC转录因子通过乙烯介导的途径参与多种植物器官的衰老过程。例如，在叶片中，ZmNAC126可加速玉米叶片的乙烯诱导衰老（Yang等人，2020年）。在果实中，AdNAC6和AdNAC7可以直接结合到乙烯合成基因AdACS1和AdACO1的启动子区域，激活它们的表达以促进乙烯合成和猕猴桃的成熟。此外，AdNAC6和AdNAC7还可以直接结合到AaTPS1启动子并激活其表达，从而在果实成熟过程中促进挥发性萜烯的合成（Wang等人，2020b年）。在花朵中，乙烯诱导的NAC转录因子DcNAP1可以促进康乃馨的衰老，而DcNAP2则具有相反的作用（Sun等人，2023年）。然而，NAC转录因子在花朵衰老过程中调节花香的潜在作用仍不清楚。
在本研究中，我们利用OfCCD1启动子作为诱饵，通过酵母单杂交（Y1H）文库筛选技术鉴定出一个与衰老相关的NAC转录因子OfNAC92。我们证明OfNAC92定位于细胞核中，缺乏转录激活活性，并且可以直接结合到OfCCD1启动子中的特定cis-元件（CACG）上，从而抑制其转录。总体而言，这些结果表明，OfNAC92通过直接抑制核心β-ionone合成基因OfCCD1来加速花朵香气的衰退，为提高采收后甜桂花的花香提供了新的遗传靶点。
实验材料与处理
实验所用植物材料为来自中国南京林业大学的O. fragrans品种‘Rixianggui’。花朵在五个开花期（S1：花蕾-花梗阶段，花蕾闭合，呈黄绿色，香味微弱；S2：花蕾眼阶段，花蕾顶端出现裂口；花瓣变黄，带有淡淡的新鲜香味；S3：初花阶段，花朵半开放，颜色较淡，香味明显增强）每天上午9:00–12:00采集。
花朵衰老过程中β-ionone含量和OfCCD1表达的下降
我们之前的转录组数据表明，在O. fragrans花朵从完全开放阶段（S4）到香味消退阶段（S5），OfCCD1的表达显著下降（图1A）。同样，对采收后的甜桂花进行的GC-MS分析显示β-ionone含量显著减少（图1B和D，补充图4），qRT-PCR分析进一步证实了采收后花朵衰老过程中OfCCD1转录本的下调（图1C）。此外，PCA分析也证实了这一趋势。
讨论
O. fragrans以其独特的香味而广受认可，这是其在香水行业和景观绿化中广泛应用的关键特征。然而，甜桂花在采收后的花香会迅速减弱（Huang等人，2025b），这大大降低了采收后花朵的观赏性和经济价值。挥发性化合物β-ionone是甜桂花特有香味的主要成分，我们发现其含量显著下降。
结论
采收后花朵在衰老过程中香气的迅速消退会显著降低其观赏性和经济价值。在本研究中，我们通过Y1H文库筛选技术在O. fragrans中鉴定出一个与衰老相关的NAC转录因子OfNAC92。OfNAC92定位于细胞核中，缺乏转录自我激活活性。Y1H和双荧光素酶实验表明，OfNAC92可以直接结合到OfCCD1启动子上并抑制其表达。启动子截短分析进一步证实了这一作用。
CRediT作者贡献声明
王嘉欣：撰写原始稿件、软件使用、实验设计、数据分析与整理。张明珠：撰写原始稿件、软件使用、实验设计、数据分析与整理。史婷婷：项目管理。杨秀莲：方法学研究、实验设计。叶云芳：实验设计、概念提出、数据分析。张春玲：撰写与编辑。王良桂：概念提出、资金筹集。岳元正：概念提出、撰写与编辑。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（资助编号：32471943、32071828、32501740）、江苏省高等教育机构自然科学基金（资助编号：24KJB220006）和江苏省高等教育机构重点学术发展计划（PAPD）的支持，同时部分资金来自国家园艺作物种质创新与利用国家重点实验室的开放资金。
