《Poultry Science》：Frizzled-4 Promotes Bone Formation in Chickens via Activation of the Canonical Wnt Signaling Pathway
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本研究针对家禽骨骼健康问题，通过RNA-seq筛选发现FZD4在鸡骨重塑过程中差异表达。研究人员通过体外过表达/敲低FZD4实验证实其可显著调控成骨标志物(ALP/Runx2/OCN等)表达，并首次在禽类模型中验证FZD4通过激活经典Wnt/β-catenin通路（上调β-catenin/下调GSK-3β）促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化和矿化，为家禽骨骼发育机制提供新靶点。
在集约化家禽养殖业中，骨骼健康问题已成为影响动物福利和生产效率的关键限制因素。骨质疏松、胫骨软骨发育不良等骨骼疾病不仅导致经济损失，更引发动物福利关切。骨骼稳态高度依赖于骨形成与骨吸收的动态平衡，而骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为具有多向分化潜能的成体干细胞，其成骨分化过程是研究骨骼发育机制的重要模型。尽管Frizzled-4(FZD4)作为卷曲蛋白家族成员在哺乳动物骨骼稳态中的作用已被证实，但其在禽类特别是鸡骨骼形成中的具体功能机制尚不明确。
为阐明这一问题，河南农业大学研究团队在《Poultry Science》发表了创新性研究。该研究首先通过RNA测序(RNA-seq)技术发现FZD4在鸡生理性骨重塑过程中呈现差异表达。研究人员从18日龄鸡胚股骨和胫骨中分离BMSCs，通过免疫荧光染色（检测CD29/CD45标志物）和成骨诱导分化实验（碱性磷酸酶(ALP)和茜素红S(ARS)染色）验证细胞特性。利用质粒转染实现FZD4基因的过表达和RNA干扰(RNAi)敲低，结合Wnt通路抑制剂XAV939处理，通过实时定量PCR(qRT-PCR)、蛋白质印迹(Western blot)等技术系统评估成骨标志基因和Wnt通路关键因子表达变化。
表征鸡BMSCs及FZD4在成骨分化早期表达
研究证实分离的P3代细胞呈现均一的纺锤形形态，CD29阳性/CD45阴性的典型BMSCs表型。成骨诱导3天出现ALP染色阳性，7天出现ARS染色阳性，且FZD4表达趋势与早期成骨标志物ALP一致，提示其可能参与成骨分化起始阶段。
FZD4促进鸡BMSCs成骨分化和矿化
过表达FZD4显著上调胶原蛋白I型α1链(Col1A1)、Runt相关转录因子2(Runx2)、ALP和骨钙素(OCN)等成骨标志物表达，增强ALP活性和矿化结节形成；而敲低FZD4则抑制这些指标。特别发现OCN在诱导7天即显著上调，可能与禽类特异性调控机制有关。
FZD4激活经典Wnt信号通路
机制研究表明，FZD4过表达显著上调β-连环蛋白(β-catenin)、原癌基因C-myc表达，降低糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)水平；Western blot验证蛋白水平变化一致。相反，敲低FZD4产生相反效应，证实FZD4通过经典Wnt/β-catenin通路发挥作用。
FZD4通过激活经典Wnt通路促进成骨分化
使用通路抑制剂XAV939处理后，FZD4过表达带来的成骨促进作用被显著逆转，关键因子表达和染色结果均恢复至接近基线水平，进一步验证FZD4的功能依赖性。
该研究首次在禽类模型中系统证实FZD4通过经典Wnt/β-catenin通路正调控BMSCs成骨分化。值得注意的是，OCN等晚期标志物在诱导早期即出现显著变化，提示禽类与哺乳动物在成骨分化时序调控上可能存在物种差异。虽然FZD4-Wnt通路轴线在物种间具有保守性，但禽类特有的骨骼代谢特征（如快速生长、髓质骨形成）可能赋予该通路独特的调控特性。研究为理解家禽骨骼发育提供了分子理论基础，也为解决养殖业骨骼疾病问题提供了潜在靶点。未来需通过体内模型进一步验证FZD4功能，并探索其上游调控机制（如非编码RNA）及其他FZD同源物的协同作用。
