《Synthetic and Systems Biotechnology》：Construction of a globally modular recombinant
Saccharomyces cerevisiae chassis for ginkgolide precursor levopimaradiene production
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本研究针对酿酒酵母天然进化途径改造导致代谢通量不稳定、菌株生长停滞等瓶颈问题，通过系统优化左旋海松二烯合酶(LPS)、调控甲羟戊酸(MVA)通路、增强乙酰辅酶A/ATP/NADPH供应等策略，成功构建了高效生产银杏内酯前体左旋海松二烯(LP)的酵母底盘。摇瓶发酵产量达792.72±69.59 mg/L，补料发酵进一步提升至1809.32±72.32 mg/L，较既往报道最高产量提升8.3倍，为二萜类化合物生物制造提供了技术框架。
在心血管疾病治疗领域，银杏叶提取物EGb 761?作为经典药物全球市场规模超百亿美元，其核心活性成分银杏内酯具有抗血栓、抗炎、神经保护等多重药理活性。然而，现有生产严重依赖银杏树提取，面临生长周期长、含量低、纯化成本高等瓶颈，而化学合成路线复杂且效率低下。利用微生物细胞工厂实现萜类化合物的绿色制造，成为突破资源约束的重要方向。
发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》的这项研究，聚焦于银杏内酯生物合成途径中的关键前体——左旋海松二烯(levopimaradiene, LP)。作为二萜类化合物，LP的生物合成依赖于甲羟戊酸(mevalonic acid, MVA)途径生成的香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate, GGPP)。尽管此前已有研究尝试在大肠杆菌、酿酒酵母等宿主中构建LP生产体系，但产量始终难以突破工业化生产门槛。特别是酿酒酵母体系存在代谢流平衡调控复杂、关键酶膜定位需求等固有挑战。
为解决这一难题，研究团队开展了系统性代谢工程改造。首先对银杏来源的左旋海松二烯合酶(LPS)进行密码子优化，并通过N端79个氨基酸转运肽序列截短，使酶活性提升9.02倍。进一步引入MBP融合标签及双位点突变(M593I;Y700F)，最终获得活性显著增强的突变酶MBP-ggggs-t79LPSM593I;Y700F。
在代谢通路重构方面，研究通过动态调控角鲨烯合酶(ERG9)表达、过表达转录因子UPC2-1、截短HMG1(tHMG1)解除反馈抑制等策略，强化MVA通路通量。特别引入异源GGPP合酶(CrtE)并与HMG2突变体(HMG2K6R)组合表达，使LP产量提升20.16倍。为解决高表达导致的菌株生长停滞，团队采用半乳糖诱导型启动子动态调控结合多拷贝Ty3转座子整合技术，成功实现代谢平衡。
在辅因子工程方面，研究通过过表达IME4提升乙酰辅酶A供应，构建SeACSL641P-ERG10融合蛋白引导碳流向MVA通路，并强化磷酸戊糖途径(PPP)限速酶ZWF1和GND1表达，使NADPH/NADP+比值提升207.9%，显著促进萜类合成。
关键技术方法包括：基因密码子优化与合成、多拷贝染色体整合(EasyCloneMulti转座子系统)、代谢通路动态调控(启动子工程)、酶蛋白工程(定点突变与融合标签)、辅因子平衡工程(NADPH再生系统)以及补料发酵工艺优化。所有实验均采用三组生物学重复，数据以均值±标准差表示。
3.1 LPS酶优化评估
通过系统评估LPS酶的N端截短、MBP标签融合及关键位点突变，发现t79LPSM593I;Y700F突变体活性最优，为后续底盘构建奠定基础。
3.2 MVA通路调控
采用启动子替换(PHXT1-ERG9)、异源CrtE引入、HMG2K6R过表达等组合策略，使LP产量提升至210.91±18.39 mg/L，但部分菌株出现生长抑制。通过半乳糖诱导型表达系统与多拷贝整合技术，最终在LD131菌株中实现560.6±10.88 mg/L产量且生长恢复正常。
3.3 碳源代谢调控
研究半乳糖代谢调控网络(Gal4p-Gal80p轴、Snf1p/Mig1p网络)对LP合成的影响，发现Mig1p敲除或Gal4p过表达均未显著提升产量，表明碳源代谢调控需更精细设计。
3.4 辅因子供应增强
通过IME4过表达提升乙酰辅酶A水平，构建SeACSL641P-ERG10融合蛋白引导碳流，并强化PPP途径增加NADPH供应，使摇瓶发酵产量达792.72±69.59 mg/L。
3.5 补料发酵优化
在优化培养基基础上进行168小时补料发酵，菌体密度(OD600)达97.769±7.43，LP产量最高达1809.32±72.32 mg/L，创下目前公开报道的最高纪录。
该研究成功构建了全球首个高效生产银杏内酯前体LP的模块化酿酒酵母底盘，产量较既往最高水平提升8.3倍。通过25个以上遗传元件的系统优化，建立了二萜类化合物微生物合成的技术范式。特别在代谢平衡调控方面，创新性采用动态表达策略解决高产出与菌株生长的矛盾，为复杂植物天然产物的异源合成提供了可借鉴的工程化框架。研究成果不仅推进了银杏内酯绿色制造进程，更对萜类化合物生物制造领域的底盘细胞开发具有重要指导意义。
