《Synthetic and Systems Biotechnology》：De novo biosynthesis of eriocitrin in
Saccharomyces cerevisiae through deep learning-guided enzyme screening and systematic metabolic engineering
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本研究针对植物提取法生产圣草枸轭苷（eriocitrin）存在的活性成分含量低、季节性限制等问题，通过深度学习指导的糖基转移酶筛选、UDP-鼠李糖合成途径重构、UDP-葡萄糖供应优化及糖苷水解酶敲除等系统代谢工程策略，在酿酒酵母中首次实现了从葡萄糖从头合成圣草枸橼苷，产量达30.5 mg/L，为黄酮二糖的可持续微生物生产提供了新范式。
圣草枸橼苷（eriocitrin）是一种具有抗氧化和抗炎活性的黄酮-7-O-二糖，在功能性食品和药物领域应用潜力巨大。然而，传统植物提取法受限于活性成分含量低、季节性波动及复杂加工流程，化学合成则面临有毒试剂、苛刻反应条件和溶剂污染等工业瓶颈。面对这些挑战，利用微生物细胞工厂实现高效生物合成成为突破生产限制的关键路径。
发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》的这项研究，通过整合生物信息学、深度学习引导的酶功能预测与多维度代谢工程改造，在模式真核微生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中构建了完整的圣草枸橼苷从头合成途径。研究团队首先采用深度学习平台REME中的TurNuP模型，对30种植物来源的类黄酮-7-O-葡萄糖基转移酶（UF7GT）进行催化常数（kcat）预测，筛选出茶树（CsGT）和拟南芥（AtGT）来源的高效酶；进而重构UDP-鼠李糖合成途径，构建自给型RHM-NRS融合酶系统以减少辅因子依赖；通过过表达URA6、YNK1等基因增强UDP-葡萄糖供应，并敲除ALG5、GLC3等竞争途径基因，使圣草枸橼苷产量从底物转化阶段的147.9 mg/L提升至从头合成的30.5 mg/L。
关键技术方法包括：基于深度学习的酶活性预测、CRISPR/Cas9介导的多基因编辑、启动子工程调控蛋白表达比例、糖苷水解酶基因敲除防止产物降解，以及HPLC定量分析代谢物。
3.1. 深度学习驱动的UF7GT发现与表征
通过整合生物信息学分析与TurNuP图神经网络模型，从30种UF7GT中预测kcat值并分层验证，最终鉴定出CsGT和AtGT为催化效率最高的酶，其重组菌株ZY05和ZY02分别合成179.2 mg/L和161.2 mg/L的圣草枸橼苷-7-O-葡萄糖苷。
3.2. UDP-鼠李糖代谢重构促进圣草枸橼苷合成
引入植物来源的UDP-鼠李糖合酶（RHM）并与拟南芥NRS/ER结构域融合，构建自给型RHM-NRS系统，优化辅因子循环。组合筛选显示AtGT、OlRHM-NRS和克里曼丁橘（Cc1,6-RhaT）为最佳酶组合，菌株ZY18产量达117.5 mg/L。
3.3. 工程化UDP-葡萄糖供应提升圣草枸橼苷产量
过表达URA6（尿苷酸激酶）和YNK1（核苷二磷酸激酶）显著增强UDP-葡萄糖合成，同时敲除ALG5（N-糖基化关键酶）和GLC3（糖原分支酶）减少代谢分流，使产量提升至147.9 mg/L。
3.4. 从头合成圣草次苷的工程菌构建
筛选Tricyrtis hirta来源F3′H与拟南芥CPR（AtCPR）为最优P450系统，通过强启动子TDH1p调控CPR表达比例，结合多拷贝质粒与基因组整合，使圣草次苷产量达237.8 mg/L。
3.5. 圣草枸橼苷从头合成途径整合
在敲除EXG1、SPR1、EGH1糖苷水解酶的底盘菌中引入优化糖基化模块，实现圣草枸橼苷、圣草次苷-7-O-葡萄糖苷及副产物奈里托林（narirutin）的同步合成，最终通过协调UDP-葡萄糖供应与竞争途径阻断，使目标产物产量提升至30.5 mg/L。
该研究首次在酿酒酵母中建立了圣草枸橼苷的从头合成路线，突破了传统生产中酶特异性低、糖苷供体不足及代谢竞争等瓶颈。通过深度学习辅助酶挖掘、合成途径模块化优化及细胞工厂系统改造，为复杂天然产物的微生物智造提供了可扩展的技术框架，尤其为水溶性黄酮苷的绿色生物制造奠定了理论基础与工程实践范例。未来通过酶工程减少副产物奈里托林生成，将进一步推动圣草枸橼苷的工业化应用。
