基于肺-血-脑轴器官特异性体外模型的纳米材料危害评估新策略

《Toxicology in Vitro》：Organ-specific in vitro models for prediction of hazard assessment of nanomaterials

本研究针对纳米材料（NMs）人体暴露风险评估的迫切需求，利用新型风险评估方法（NAMs），构建了模拟肺-血-脑轴的多器官体外模型。研究人员通过气-液界面（ALI）暴露三细胞肺模型、人全血模型及星形胶质细胞-神经元共培养模型，系统评估了二氧化铈（CeO2）纳米材料和银（Ag）纳米线的生物效应。结果表明，不同尺寸和形态的NMs可引发器官特异性毒性反应，如CeO2-3.5 nm表现肺毒性，其条件培养基可触发脑细胞炎症反应。该研究为下一代风险评估（NGRA）提供了重要的体外研究框架和科学依据。

　　

随着纳米技术的飞速发展，纳米材料（NMs）在生产生活中的应用日益广泛，随之而来的是人类暴露风险的显著增加。传统的风险评估策略严重依赖动物实验，不仅耗时耗力，而且在物种外推方面存在局限性。因此，开发能够准确预测纳米材料对人体健康影响的新方法（NAMs）已成为当务之急。在这一背景下，一项发表于《Toxicology in Vitro》的研究为我们带来了新的视角。该研究由Laura Maria Azzurra Camassa等人完成，他们巧妙地构建了一套模拟人体“肺-血-脑轴”的器官特异性多细胞体外模型，旨在更真实、更全面地评估纳米材料的潜在危害。

为了回答纳米材料如何通过肺部暴露影响全身，特别是神经系统这一关键问题，研究团队设计了一套整合性的实验方案。他们选用了三种不同尺寸和形态的二氧化铈（CeO₂）纳米材料（3.5 nm, 50 nm, 以及10 nm x 10 nm的“邮票”状结构）和银（Ag）纳米线作为研究对象。研究的核心是三个相互关联的体外模型：一个包含肺泡上皮细胞（A549）、分化巨噬细胞（dTHP-1）和内皮细胞（EA.hy926）的三细胞肺模型，用于模拟肺泡-毛细血管屏障；一个离体人全血模型，用于评估全身免疫和炎症反应；以及一个由人星形胶质细胞（1321N1）和神经元（SH-SY5Y）组成的共培养模型，用于探究神经毒性。纳米材料通过气-液界面（ALI）系统暴露于肺模型，以模拟真实的吸入暴露场景。暴露后，收集肺模型基底侧的条件培养基（CM），用于处理脑细胞共培养模型，从而模拟纳米材料或其引发的信号分子经血液循环间接影响大脑的过程。

研究采用了一系列关键技术方法。纳米材料在暴露前进行了详细的物理化学表征，包括动态光散射（DLS）测定流体动力学直径和Zeta电位。细胞毒性通过alamarBlue法检测。遗传毒性（DNA损伤）通过酶修饰的彗星实验（Comet Assay）进行评估。基因表达谱分析采用定制化的RT²Profiler PCR阵列和实时定量PCR（RT-qPCR）技术，重点关注炎症、氧化应激、细胞死亡等相关基因。利用人全血模型，通过流式细胞术和酶联免疫吸附试验（ELISA）分析了补体系统激活（如末端补体复合物TCC、CD11b表达）以及细胞因子/趋化因子的释放。所有实验均设置了严格的溶剂对照和阳性对照，并进行了多次独立的生物学重复以确保结果的可靠性。

3.1. 纳米材料的表征

研究人员首先对所用纳米材料进行了详尽的表征。结果显示，所有材料的细菌内毒素污染水平均低于可接受限值。动态光散射（DLS）测得的纳米材料流体动力学直径均大于供应商提供的标称尺寸，表明其在分散液中存在一定程度的聚集。Zeta电位分析表明，CeO₂-50 nm和CeO₂stamps的分散液相对更稳定。这些理化性质为其后续的生物学效应奠定了基础。

3.2. NMs暴露对肺模型细胞活力和DNA损伤的影响

暴露24小时后，细胞活力检测显示，除高剂量（8 μg/cm²）的CeO₂-3.5 nm在基底侧（内皮细胞）引起显著性细胞活力下降外，其他纳米材料在测试剂量下均未引起显著的细胞毒性。彗星实验结果表明，所有测试的纳米材料均未引起显著的DNA链断裂或氧化性碱基损伤。

3.3. RT2 Profiler PCR阵列的基因表达分析

基因表达分析揭示了纳米材料更细微的生物学效应。在肺模型顶侧（上皮/巨噬细胞），CeO₂-50 nm显著上调了表面活性蛋白A（SPA）、细胞表面死亡受体（FAS）和血红素加氧酶-1（HMOX1）的基因表达；而CeO₂-3.5 nm则下调了SPA。Ag纳米线显著上调了MIP-1β、G-CSF、CXCL1和HMOX1。在基底侧（内皮细胞），CeO₂-3.5 nm、CeO₂-50 nm和Ag纳米线均上调了HMOX1的表达。这些结果表明，不同纳米材料能特异性地激活肺屏障不同层面的应激和炎症通路。

3.4. NMs对人全血模型中补体激活和细胞因子诱导的影响

在全血模型中，纳米材料表现出对先天免疫系统的调节作用。高剂量的CeO₂-3.5 nm降低了终端补体复合物（TCC）的蛋白水平，而CeO₂-50 nm和Ag纳米线则增加了TCC。所有纳米材料均能激活粒细胞和单核细胞上的CD11b⁺。在细胞因子/趋化因子分析中，不同纳米材料展现了迥异的效应模式，例如CeO₂-3.5 nm在高浓度下增加了IL-1β和MCP-1，而Ag纳米线则在较高浓度下抑制了多种细胞因子的产生。这提示纳米材料的尺寸和形状显著影响其与血液成分的相互作用和免疫激活潜力。

3.5. NMs对星形胶质细胞和神经元细胞活力及基因表达的影响

为了评估纳米材料的间接神经毒性，研究人员用肺模型暴露后的条件培养基处理脑细胞共培养模型。结果显示，Ag纳米线的条件培养基导致了脑细胞活力的显著下降。在基因表达层面，暴露于CeO₂-50 nm条件培养基的脑细胞表现出IL-1β、NF-κB和HMOX1基因的显著上调，这表明即使纳米材料本身未直接到达大脑，其引发的肺部炎症信号也可能通过血液循环间接导致神经炎症反应。

研究的讨论部分对上述发现进行了深入整合。文章指出，纳米材料的毒性不仅取决于其化学组成，尺寸、形状、表面电荷等理化性质也至关重要，它们共同影响纳米材料在生物体内的归宿和生物相互作用。例如，小的CeO₂-3.5 nm纳米颗粒表现出更强的肺毒性和独特的血液相容性，而较大的CeO₂-50 nm则更易触发补体激活和间接的神经炎症信号。Ag纳米线则显示出直接的细胞毒性潜力，特别是在脑细胞中。

该研究的结论强调，将器官特异性的多细胞体外模型串联起来，能够有效地模拟复杂的生理系统，如肺-血-脑轴。这种方法能够捕捉到单一模型无法揭示的跨器官效应，为纳米材料的下一代风险评估（NGRA）提供了更接近人体生理的相关数据和更具预测性的工具。尽管当前模型尚未通过微流体芯片进行物理连接，但此研究成功证明了利用相对独立的先进体外模型进行整合性危害评估的可行性和价值。这项工作标志着在推动更符合伦理、更高效、更具人体相关性的安全评估策略方面迈出了重要一步，为未来化学品和纳米材料的风险管理奠定了坚实的科学基础。