高通量生物催化平台实现异构海人酸类天然产物的高效筛选

《Cell Reports Physical Science》：A high-throughput biocatalytic platform for screening isomeric kainoid natural products

针对酶催化反应中同分异构体产物难以高通量筛选的瓶颈，Shepherd和Ramachandra等开发了一种无需色谱分离的MALDI-TIMS-MS新平台。该技术成功应用于KabC酶突变体库的快速筛选，鉴定出7个KA lactone (KAL)产量显著提升的优良变体，为生物催化剂发现和高通量分析工作流提供了强大工具。

在生物催化技术迅猛发展的今天，科学家们能够通过定向进化等手段构建包含数千个突变体的大型酶库。然而，如何从这些海量变异体中快速筛选出能够高效催化特定反应的优质酶种，仍是一个巨大挑战。这一问题在酶反应产物为同分异构体（结构相似但原子排列方式不同的分子）时尤为突出——传统质谱技术无法区分它们，而借助液相色谱分离又严重拖慢筛选速度。

以海人酸合酶（KabC）为例，这种属于非血红素铁/α-酮戊二酸依赖型双加氧酶（Fe/αKG）家族的酶，能够催化底物prekainic acid (PKA)转化生成两种同分异构体产物：海人酸（KA，一种强效离子型谷氨酸受体激动剂，广泛应用于神经科学研究）和KA内酯（KAL，具有受体拮抗活性）。尽管KA和KAL分子式完全相同（C₁₀H₁₅NO₄），它们的生物活性却截然相反。有趣的是，来自不同海藻的KabC同源酶（如DsKabC和GfKabC）倾向于产生不同比例的KA和KAL，这暗示通过蛋白质工程手段调控其异构体选择性具有巨大潜力。但实现这一目标的前提是建立能快速区分并定量这两种异构体的高通量筛选方法。

为了解决这一关键技术瓶颈，由Shepherd和Ramachandra等领导的研究团队在《Cell Reports Physical Science》上报道了一种创新的高通量生物催化筛选平台。该平台巧妙地将基质辅助激光解吸电离（MALDI）的快速分析优势与 trapped ion mobility spectrometry (TIMS，捕获离子淌度谱) 强大的异构体分离能力相结合，开发出无需液相色谱步骤的MALDI-TIMS-MS方法，实现了对KabC酶突变体库中同分异构体产物的直接、快速、精准分析。

研究人员为开展此项研究，主要运用了几项关键技术：1) 蛋白质工程策略，包括基于序列比对和AlphaFold结构预测的定点突变、DNA洗牌技术构建嵌合酶库；2) 高通量微生物培养与样品制备，将表达KabC突变体的E. coli菌落直接在含有底物的琼脂平板上培养，使酶表达和催化反应同步进行；3) 核心分析技术MALDI-TIMS-MS，通过优化淌度分离参数（如ramp time和1/K₀范围），并采用平行反应监测-并行累积连续碎裂（PRM-PASEF）模式，实现了KA和KAL的近基线分离和高灵敏度检测；4) 配套的数据分析流程，利用自定义Python脚本对高通量筛选数据进行自动处理和可视化，快速锁定目标突变体。

半理性设计与定点突变及融合酶构建

研究人员首先利用AlphaFold 2对DsKabC和GfKabC进行结构预测，并通过多序列比对选取了13个可能影响产物选择性的位点进行定点突变（SDM）。成功构建了7个单点突变体，其中4个（S107C, G122N, E128K, Y347F）被纯化并进行体外表征。结果表明，E128K和Y347F突变体能略微提高KAL产量（分别增加3%和7%），而G122N突变则完全消除了KAL的产生并大幅降低了底物转化率。Y347F是唯一能保持与野生型DsKabC相似的高底物转化率（>99%）的突变体。随后，研究者尝试将GfKabC中较大的低同源性区域（C端α螺旋区和内部刚性环）替换到DsKabC骨架中构建“融合”酶，但未能显著改变异构体比例，且底物转化率大幅下降。这些结果揭示了海人酸合酶结构与活性关系的复杂性，促使研究转向随机突变策略。

MALDI-TIMS-MS用于海人酸天然产物的优化

为实现高通量筛选，研究团队重点优化了TIMS-MS参数以分离KA和KAL。TIMS通过平衡气流拖曳力和反向电场梯度来“捕获”离子，并通过“降斜坡”方式依次释放离子实现分离。通过延长ramp time（从50 ms增至200 ms）并缩小1/K₀扫描范围，成功实现了KA和KAL的近基线分离，其淌度值分别为0.693 V s/cm²(对应CCS 147.7 ?²) 和0.713 V s/cm²(对应CCS 152.0 ?²)。研究还发现，与电喷雾电离（ESI）相比，MALDI电离条件下KA和KAL的信号强度更为接近，更有利于相对定量。为了降低菌落样品复杂的化学背景噪声，研究采用了PRM-PASEF模式，该模式通过四极杆离子选择与TIMS分离同步，能够特异性富集目标离子（m/z 212.0918），显著简化了数据谱图。

MALDI-TIMS-MSI用于优化琼脂平板上的KabC表达

为了建立高效的菌落水平筛选流程，研究人员优化了在琼脂平板上直接进行酶表达和催化反应的条件。他们借鉴了实验室之前开发的IDBac平台的经验，将表达KabC的E. coli菌落直接点在含有1 mM PKA底物的LB琼脂平板上。通过MALDI质谱成像（MALDI-TIMS-MSI）技术，系统评估了IPTG浓度和培养温度对产物形成的影响。出乎意料的是，省略IPTG诱导并在菌落形成后（37°C，10小时）将平板转移至30°C继续培养6小时，获得了最高的产物信号强度。MSI结果清晰地显示，Y347F突变体菌落中KAL的相对信号强度高于野生型DsKabC，这与体外LC-MS分析结果一致，验证了该平台用于相对定量的可靠性。

KabC嵌合库的生成与通过MALDI-TIMS-MS进行高通量筛选

在理性设计效果有限的情况下，研究团队转向DNA洗牌技术，将经过密码子优化的dsKabC和gfKabC基因进行重组，构建了一个嵌合突变库。该库共包含318个变异体。筛选过程采用高通量模式：将菌落直接转移至MALDI靶板上，使用TM Sprayer均匀喷涂基质，然后利用MALDI PharmaPulse (MPP) 软件进行快速数据采集（每个样品约5秒，总耗时小于30分钟）。通过自定义Python脚本对导出的数据进行处理，以热图形式可视化每个突变体相对于DsKabC对照的KAL产量变化（Fold Change）。筛选结果显示，DNA洗牌显著富集了活性变异体，许多突变体的KAL产量倍增（Fold Change ≥ 4）。在总强度超过阈值的57个活性变异体中，36个主要产生KAL，21个主要产生KA，而没有变异体产生接近等量的KA和KAL。

选定的DNA洗牌KabC变体概述

从筛选出的突变体中，研究人员选择了18个（包括7个嵌合酶）进行测序和体外验证。对这7个嵌合酶进行纯化并开展体外酶活测试，其中5个变体表现出比GfKabC（~93%）更高的KAL相对产量（~94% 至 >99%）。特别值得注意的是，SL44和SL306两个变体不仅几乎完全转向KAL生产，而且底物消耗率（分别>99%和~98%）也高于GfKabC（~86%）。MALDI-TIMS-MS测定的KAL相对丰度与体外LC-MS结果高度相关（R²= 0.95）。此外，SL44和SL306能够以N端His标签的形式在E. coli中良好表达，克服了GfKabC需要麦芽糖结合蛋白（MBP）标签才能可溶表达的局限性。SL306在经过4个月-70°C储存和多次冻融循环后，仍能在不同酶浓度（0.5–5.0 mol %）下保持活性，表现出优于GfKabC和SL44的体外稳定性。通过AlphaFold 3对七个嵌合酶的结构预测发现，所有高KAL产量变体的活性位点周围蛋白质环境均源自GfKabC，而N端和C端序列变异较大，表明产物分布主要由活性中心及邻近的二级球相互作用决定，而非末端区域。

综上所述，本研究成功创建了一个高效、免色谱的MALDI-TIMS-MS高通量筛选平台，专门用于分析海人酸合酶催化产生的同分异构体产物。该平台将样品前处理时间从数天缩短至一天以内，分析通量极高（每秒级），并保持了与金标准LC-MS方法高度一致的分析准确性。通过对DNA洗牌库的筛选，成功获得了多个具有优良特性的KabC变体，特别是SL44和SL306，它们不仅实现了产物选择性从KA到KAL的根本性转变，还兼具高底物转化率和良好的表达稳定性。这项研究的意义在于：首先，它为快速筛选产生同分异构体产物的酶突变体提供了强大的通用工具，解决了生物催化领域的一个关键瓶颈；其次，所获得的优良酶变体不仅是探究Fe/αKG酶家族结构与功能关系的理想模型，也为未来生物合成具有不同神经活性的非天然海人酸类化合物奠定了基础；最后，该平台展示了MALDI-TIMS-MS与PRM-PASEF联用在复杂生物样品直接分析中的巨大潜力，其原理可扩展至其他类型的异构体（如非对映异构体）乃至通过衍生化策略可能涉及的对映异构体的分析，为更广泛的合成生物学和药物发现应用开辟了新途径。