水稻抗病新机制：真菌效应蛋白SCRE2通过抑制OsRNS4介导的跨界RNAi促进稻曲病菌侵染

《SCIENCE ADVANCES》：OsRNS4-mediated cross-kingdom RNA interference is inhibited by Ustilaginoidea virens effector SCRE2 to promote infection in rice

本研究聚焦稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)效应蛋白SCRE2的致病机制，发现其通过靶向水稻S类核糖核酸酶OsRNS4，抑制该蛋白结合miRNA的能力，从而阻断植物通过胞外囊泡(EVs)介导的跨界RNA干扰(RNAi)途径。研究首次揭示OsRNS4作为无催化活性的RNA结合蛋白，可携带miR528-5p等小RNA进入病菌细胞，沉默致病关键基因UvSfk1；而SCRE2通过竞争性结合OsRNS4，破坏其RNA装载功能，为真菌病害防治提供了新靶点。

　　

在水稻生产过程中，有一种名为稻曲病的真菌病害悄然蔓延，它由稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)引起，专门侵染水稻花器，形成令人头疼的"假稻穗"。这种病害不仅造成产量损失，更严重的是，病菌产生的毒素还会污染稻谷，威胁人畜健康。面对这一顽敌，植物自身也演化出了精妙的防御系统，其中就包括一种被称为"跨界RNA干扰"的分子防卫机制——植物能够将特定的小RNA分子送入入侵的病菌体内，像精确制导的导弹一样，沉默病菌致病基因的表达，从而抑制病害发展。

然而，道高一尺魔高一丈，病原菌也不会坐以待毙。它们会向宿主细胞分泌一系列被称为"效应蛋白"的分子武器，用以干扰植物的免疫防御。在稻曲病菌的军火库中，有一个名为SCRE2(Small Secreted Cysteine-Rich Effector 2)的效应蛋白此前已被证明是病菌致病的关键因子，但其具体作战方式一直是个谜团。为了揭开SCRE2的分子伪装，中国科学家团队在《科学进展》(SCIENCE ADVANCES)上发表了他们的最新发现。

研究人员运用了多种前沿技术手段来探索这一科学问题。他们通过酵母双杂交技术从水稻防御相关基因迷你库中筛选SCRE2的互作蛋白；利用免疫共沉淀(Co-IP)和凝胶阻滞实验(EMSA)验证蛋白质相互作用及RNA结合特性；采用微量热泳动(MST)技术精确测定蛋白与RNA的结合亲和力；通过细胞外囊泡(EVs)分离和蛋白酶保护实验分析OsRNS4的分泌途径；结合RNA免疫共沉淀测序(RIP-seq)鉴定OsRNS4结合的miRNA种类；并利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建水稻OsRNS4和病菌UvSfk1的基因敲除突变体，进行功能验证。

SCRE2靶向水稻RNase样蛋白OsRNS4

研究人员首先利用酵母双杂交系统进行"钓饵"实验，发现SCRE2能够特异性与水稻中的一个S类核糖核酸酶家族成员OsRNS4相互作用。进一步的体内外实验证实，这种相互作用是特异且直接的——SCRE2不与OsRNS4的同源蛋白OsRNS6结合，其他效应蛋白如SCRE1也不与OsRNS4结合。这一发现为后续研究指明了方向。

OsRNS4正向调控水稻免疫力

为了验证OsRNS4是否参与水稻免疫，研究团队通过基因敲除和过表达技术创建了不同遗传背景的水稻材料。实验结果表明，OsRNS4功能缺失的水稻突变体对稻曲病的抵抗力显著下降，病穗上的稻曲球数量明显增多；相反，过表达OsRNS4的水稻株系则表现出更强的抗病性。在分子水平上，OsRNS4缺失还导致几丁质(真菌细胞壁成分)诱导的活性氧(ROS)爆发和防御基因PR5表达水平降低。这些证据共同表明，OsRNS4是水稻免疫系统中的一名正调控因子。

OsRNS4的RNA结合能力是其免疫功能的基石

深入探究OsRNS4的作用机制时，研究人员发现了一个有趣现象：虽然OsRNS4属于核糖核酸酶T2家族，但它却缺乏酶活性。序列分析显示，该家族中保守的催化位点组氨酸(His⁶⁶和His¹²⁵)在OsRNS4中被赖氨酸(Lys)和酪氨酸(Tyr)所取代。然而，OsRNS4却保留了强大的RNA结合能力。通过定点突变技术，研究人员证实了四个预测的RNA结合残基(Tyr³⁴、Tyr⁴³、Glu¹⁹⁸和Tyr²⁰⁰)对OsRNS4与RNA的结合至关重要。当将这些位点突变后，OsRNS4的RNA结合能力显著下降，其介导的抗病功能也随之减弱。这表明OsRNS4是通过其RNA结合能力，而非酶活性，来行使免疫功能的。

OsRNS4通过EV依赖途径进行分泌

作为免疫因子，OsRNS4需要被分泌到细胞外空间才能与入侵的病菌接触。研究发现，OsRNS4虽然带有预测的信号肽，但其分泌不依赖于经典的分泌途径，而是通过一种非常规的途径——胞外囊泡(EVs)来实现。实验证明，OsRNS4与水稻中的四跨膜蛋白OsTET13(拟南芥TET8的同源物)相互作用，并依赖于内体分选复合物所需的FREE1蛋白，通过多泡体(MVBs)形成的EVs被分泌到细胞外。蛋白酶保护实验显示，OsRNS4与EVs紧密结合，受到EV膜的保护。

OsRNS4介导miR528-5p的跨界转运

那么，OsRNS4结合的是哪些RNA？它们又如何帮助水稻抵抗病害呢？通过RNA免疫共沉淀测序(RIP-seq)，研究人员发现OsRNS4能够结合一组特定的水稻miRNA，这些miRNA的靶基因富集在植物-病原互作和激素信号转导等通路。特别引人注目的是，OsRNS4结合的miRNA中存在一个高度保守的基序"AGAGGA"。其中，miR528-5p与OsRNS4的结合通过凝胶阻滞实验(EMSA)得到了直接验证。更重要的是，研究人员在稻曲球中检测到了水稻来源的miR528-5p，且其丰度与水稻中OsRNS4的表达水平正相关，表明OsRNS4确实负责将miR528-5p转运至病菌侵染部位。

SCRE2抑制OsRNS4与RNA的结合

作为对抗手段，SCRE2如何干扰这一防御系统？研究发现，SCRE2与OsRNS4的相互作用发生在EVs上，且这种相互作用在几丁质和flg22(两种典型的病原相关分子模式)处理后增强。通过竞争性结合实验，研究人员发现SCRE2能够以剂量依赖的方式抑制OsRNS4与RNA的结合。当SCRE2存在时，OsRNS4与miR528-5p的结合显著减弱。相应地，在SCRE2基因敲除的稻曲病菌株侵染形成的稻曲球中，miR528-5p的丰度显著升高。这表明SCRE2通过干扰OsRNS4的RNA装载功能，来抑制跨界RNAi。

miR528-5p靶向的UvSfk1对稻曲病菌致病性至关重要

最后，研究揭示了这一跨界RNAi系统的最终目标。生物信息学分析预测，miR528-5p能够靶向稻曲病菌中的一个重要基因UvSfk1(编码FK506抑制子Sfk1)。实验证明，外源添加miR528-5p能够被稻曲病菌吸收，并导致UvSfk1表达下调，同时显著抑制病菌的分生孢子产生。通过CRISPR-Cas9技术构建的UvSfk1基因敲除菌株在致病性和产孢能力上均显著缺陷，而回补菌株则恢复了野生型的表型。这证实UvSfk1是稻曲病菌致病的关键基因，也是水稻miR528-5p作用的分子靶标。

这项研究系统阐明了水稻与稻曲病菌之间一场精彩的分子攻防战：水稻利用OsRNS4作为"运输车"，通过EVs将防御性miRNA(如miR528-5p)送入病菌细胞，靶向沉默致病基因UvSfk1；而病菌则分泌效应蛋白SCRE2作为"干扰器"，通过竞争性结合OsRNS4，阻断其miRNA装载功能，从而逃逸宿主的RNAi防御。这一发现不仅揭示了植物-病原互作中一种全新的致病机制，为开发新型病害防控策略提供了分子靶标，更重要的是，它首次报道了病原菌效应蛋白通过直接靶向宿主RNA结合蛋白来抑制跨界RNAi的对抗策略，深化了我们对生物间共进化分子对话的理解。由于OsRNS4同源蛋白在单子叶植物中具有保守的RNA结合位点，这一机制可能在其他作物抗病性中也发挥重要作用，具有广阔的农业应用前景。