《SCIENCE ADVANCES》：Overcoming host restrictions to enable continuous passaging of GII.3 human norovirus in human intestinal enteroids
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本研究针对人诺如病毒（HuNoV）体外培养无法连续传代的难题，通过RNA-seq筛选发现CXCL10、CXCL11和CCL5等趋化因子是关键宿主限制因子。研究人员利用CXCR3/CCR5/CCR2拮抗剂TAK-779，成功实现了GII.3型HuNoV在两种人肠道类器官（HIEs）中的高效复制和连续传代（最高达15代），并获得了高滴度病毒储备液。该突破建立了可规模化的HuNoV体外培养系统，为病毒结构、生化及治疗研究开辟了新途径。
在病毒学研究领域，人诺如病毒（Human norovirus, HuNoV）一直是令人头疼的难题。作为全球急性病毒性胃肠炎的主要病原体，HuNoV每年导致约6.77亿病例和超过21.3万死亡病例。尽管科学家们经过数十年努力，但该病毒始终难以在实验室条件下实现稳定培养，特别是无法进行连续传代，这严重阻碍了疫苗研发、抗病毒药物筛选和基础机制研究。
传统的HuNoV研究高度依赖患者粪便样本作为病毒来源，这些样本不仅数量有限、滴度不一，还存在个体差异大、批次间不可比等问题。虽然人肠道类器官（Human Intestinal Enteroids, HIEs）模型的建立为HuNoV研究带来了突破，但病毒在HIEs中最多只能传代4次，且病毒产量逐代递减，无法满足大规模研究需求。这一瓶颈背后的机制尚不清楚，但提示存在未被认识的宿主限制因素在抑制病毒复制。
为攻克这一难题，研究人员开展了一项创新性研究。他们假设，在遗传修饰后病毒复制增强的HIEs中，仍存在某些宿主因子限制着病毒的持续复制。通过RNA测序（RNA-seq）分析，团队发现了一组关键趋化因子——CXCL10、CXCL11和CCL5，它们在病毒感染后显著上调，可能是阻碍病毒复制的"守门人"。
基于这一发现，研究人员将目光投向了TAK-779，一种已知的CXCR3/CCR5/CCR2拮抗剂。令人振奋的是，TAK-779处理显著增强了GII.3型HuNoV在HIEs中的复制，效果呈剂量和时间依赖性。更重要的是，在TAK-779存在下，研究人员首次成功实现了GII.3型HuNoV的连续传代——在J4FUT2-KI和J8FUT2-KI两种HIEs中分别传至10代和15代，突破了此前最多4代的限制。
这项研究的创新之处不仅在于建立了可持续的HuNoV培养系统，还深入探索了病毒在传代过程中的遗传演化。通过对传代病毒进行全基因组测序，研究人员发现了一个共识水平的突变（I331T）以及多个动态变化的变异位点，这些发现为了解病毒适应机制提供了重要线索。
值得注意的是，TAK-779对不同基因型HuNoV的效果存在差异。它能增强GII.17和GI.1型的复制，但对常见的GII.4型无效。这种株系特异性提示不同基因型HuNoV可能采用不同的策略与宿主相互作用，这一发现为理解HuNoV的宿主适应机制提供了新视角。
该研究成功发表于《SCIENCE ADVANCES》期刊，标志着HuNoV研究领域的一个重要里程碑。通过突破技术瓶颈，研究人员不仅建立了可规模化的体外培养系统，还为后续的病毒结构解析、致病机制研究和抗病毒药物开发奠定了坚实基础。
在研究过程中，团队运用了多项关键技术：利用人肠道类器官（HIEs）培养系统，包括遗传修饰的J2STAT1-KO、J4FUT2-KI和J8FUT2-KI细胞系；通过RNA-seq分析病毒感染后的转录组变化；采用TAK-779进行化学干预研究；通过RT-qPCR（逆转录定量聚合酶链反应）定量病毒复制；利用免疫荧光技术检测病毒蛋白表达；进行病毒传代实验并测定TCID50（50%组织培养感染剂量）；采用捕获测序技术分析病毒基因组变异。所有HIE细胞系均来自贝勒医学院胃肠道实验模型系统核心维护的细胞库，符合伦理规范。
RNA测序揭示细胞因子信号通路是HIEs对GII.3感染的共同反应
研究人员比较了四种HIEs（J2、J4、J2STAT1-KO和J4FUT2-KI）在GII.3感染后的转录组变化。结果显示，虽然不同HIE系对感染的反应存在差异，但趋化因子信号通路在遗传修饰的HIEs中成为主要的免疫相关上调通路。特别是CXCL10、CXCL11和CCL5等趋化因子在J2STAT1-KO和J4FUT2-KI中显著上调，提示它们可能在限制病毒复制中发挥重要作用。
TAK-779以剂量依赖性方式增强GII.3 HuNoV在HIE系中的复制
通过剂量反应实验，研究人员发现TAK-779能显著增强GII.3在J2、J4FUT2-KI和J8FUT2-KI中的复制，最佳效果出现在30μM浓度下，使病毒基因组当量（GEs）增加约1个对数级。细胞毒性实验证实该浓度在实验条件下安全有效。
TAK-779增强GII.3 HuNoV复制具有时间和剂量依赖性并促进病毒传播
时间进程实验显示，TAK-779的增强效果在24-48小时最为明显，72小时达到平台期。免疫荧光分析进一步证实TAK-779处理增加了病毒感染细胞的数量，表明其不仅能增强复制还能促进病毒在细胞间的传播。
TAK-779处理通过降低GE/TCID50显著增强病毒感染性
TCID50实验表明，TAK-779处理显著降低了建立感染所需的病毒基因组数量，说明该化合物不仅能增强病毒复制，还能提高宿主细胞对病毒的易感性。
TAK-779促进GII.3 HuNoV在HIEs中的持续传代
在TAK-779存在下，GII.3在J4FUT2-KI和J8FUT2-KI中成功传代至10代和15代，而在无TAK-779的对照组中，病毒复制在3-4代后即停止。免疫荧光检测证实传代病毒仍能表达结构蛋白（VP1）和非结构蛋白（VPg和NTPase），保持感染性。
GII.3 HuNoV传代实现高滴度病毒储备液的制备
研究人员从传代病毒中制备了多个病毒储备液，这些储备液在感染实验中表现出与原始粪便病毒相当的复制能力。电子显微镜观察确认了病毒样颗粒的存在，证实了生产性复制和病毒粒子的释放。
连续传代中发现适应性单核苷酸变化
基因组测序分析发现，传代过程中出现了一个共识水平的突变（I331T，位于VP1的P2结构域）以及多个动态变化的变异位点。结构建模提示这些变异可能影响病毒衣壳稳定性或聚合酶功能，反映了病毒在传代过程中的适应性演化。
TAK-779增强GII.17和GI.1而非流行性GII.4 HuNoV的复制
值得注意的是，TAK-779对不同基因型HuNoV的效果存在差异：它能增强GII.17和GI.1的复制，但对GII.4悉尼株、GII.4丹哈格株和GII.4亨特株无效。Luminex检测显示GII.4感染不诱导趋化因子产生，提示其可能具有独特的免疫逃避机制。
综合研究结果和讨论，该研究的突破性意义体现在多个方面。首先，TAK-779的使用成功解决了HuNoV研究领域长期存在的技术瓶颈，首次实现了病毒在体外培养系统中的持续传代。这一突破减少了对临床粪便样本的依赖，为不同实验室开展可重复性研究提供了可能。
其次，研究揭示了上皮细胞趋化因子信号在限制HuNoV复制中的重要作用，这一发现扩展了对肠道抗病毒防御机制的认识。与传统关注的干扰素信号通路不同，该研究强调了趋化因子在抗病毒防御中的关键地位。
第三，病毒在传代过程中出现的遗传变异为了解病毒适应机制提供了宝贵信息。特别是VP1蛋白P2结构域的适应性突变，与免疫功能低下患者中观察到的慢性感染变异区域相符，提示这些区域在病毒宿主适应中具有重要作用。
最后，研究发现的株系特异性效应（TAK-779对GII.4无效）提示不同基因型HuNoV可能采用不同的策略与宿主相互作用，这一发现为理解病毒进化提供了新视角。
总体而言，这项研究通过创新性地靶向趋化因子信号通路，成功建立了可持续的HuNoV体外培养系统，为病毒学研究、疫苗开发和抗病毒治疗研究提供了强大工具。未来，这一平台将支持更深入的病毒结构解析、宿主互作机制研究和药物筛选工作，推动HuNoV研究进入新的发展阶段。
