手性2,4-二苯基噁唑啉的合成、生物活性与杀螨机制研究

《Advanced Agrochem》：Synthesis, Biological Activity, and Acaricidal Mechanism of Chiral 2,4-Diphenyloxazolines

为了解决现有杀螨剂抗性日益严重的问题，研究人员针对高活性2,4-二苯基噁唑啉类杀螨剂，开发了新型手性合成路线，获得了对映异构体。研究比较了对映体间的杀螨活性差异，确认其与商品化杀螨剂乙螨唑（etoxazole）同为几丁质合成酶1（CHS1）抑制剂，为新型手性杀螨剂的开发提供了关键数据。

　　

在农业生产中，螨类害虫是困扰许多经济作物如苹果、柑橘、棉花和多种蔬菜的重要威胁。为了控制这些“看不见的敌人”，科学家们研发了多种化学杀螨剂，其中乙螨唑（etoxazole）作为一种低毒高效的品种自1998年问世以来得到了广泛应用。然而，正如细菌对抗生素会产生耐药性一样，长期、广泛地使用乙螨唑也导致了螨类抗药性的逐渐增强，这为农业生产敲响了警钟，亟需开发新型的、作用机制更优的杀螨剂来应对这一挑战。

乙螨唑属于2,4-二苯基噁唑啉类化合物，其分子中含有一个手性中心，意味着它存在像左右手一样不能完全重叠的两种空间构型异构体，即S-型和R-型对映体。在自然界和生物体内，手性分子的两种“手性”可能表现出截然不同的生物活性、环境行为甚至毒性。例如，有些农药的有效成分可能只集中在其中一种构型上，而另一种构型则可能活性很低甚至有害。因此，深入研究手性农药的对映异构体差异，对于筛选出高活性、低风险的候选农药，实现精准、绿色的害虫防控具有重要意义。

在此之前，南开大学的王庆民、刘玉秀等研究团队以乙螨唑为先导结构，对其4-苯基部分进行了一系列结构修饰，设计合成了多系列含有肟醚、硫醚、醚或氮杂环的2,4-二苯基噁唑啉类衍生物，并发现部分化合物的杀螨活性（特别是对螨卵和幼虫）甚至优于乙螨唑。值得注意的是，这些先前合成的化合物都是外消旋体（即S型和R型等量混合）。为了明确哪个“手性”版本是真正的“活性担当”，并评估其对非靶标生物的环境风险，研究人员决心开启这项针对手性2,4-二苯基噁唑啉的深入探索。这项研究最终发表在《Advanced Agrochem》期刊上。

为了开展这项研究，研究人员运用了多个关键的技术方法。在合成化学方面，核心是Sharpless不对称氨羟化反应，该反应用Boc保护的胺作为氮源，使用特定的手性配体（(DHQ)₂PHAL或(DHQD)₂PHAL）来高对映选择性地合成关键手性中间体，从而获得高光学纯度（ee值达95%以上）的S-和R-型目标化合物。在生物活性评价方面，采用了叶片浸渍法测定化合物对朱砂叶螨（T. cinnabarinus）卵的杀螨活性。在作用机制研究层面，综合运用了体外几丁质合成酶1（TuCHS1）抑制活性测定、对乙螨唑抗性螨株（T. urticae）卵的活性测试以及分子对接模拟。其中，分子对接利用AlphaFold3预测了朱砂叶螨几丁质合成酶1（TcCHS1）的三维结构，并使用AutoDock Vina将化合物对接到预测的活性口袋中。此外，还评估了候选化合物对非靶标水生生物大型溞（D. magna）和羊角月牙藻（P. subcapitata）的毒性。

研究结果

合成

研究人员成功开发了一条高效的不对称合成路线，以获得高对映体纯度的样品。他们最初尝试了多种手性合成或拆分路线，但效果不理想。最终，他们聚焦于利用Sharpless不对称氨羟化反应，以4-氯甲基苯乙烯为原料，通过使用特定的手性配体和控制反应条件，成功高收率、高对映选择性地合成了关键手性氨基醇中间体S-8和R-8，并进一步转化为目标手性噁唑啉化合物S-I和R-I。不对称氨羟化反应展现了优异的对映选择性，S-5b和R-5b的ee值分别达到了95%和96%。

杀螨活性

获得手性异构体后，研究人员测试了这些化合物在1 mg/L浓度下对朱砂叶螨卵的杀螨活性。数据显示，大多数外消旋体在1 mg/L浓度下对螨卵孵化的抑制率可达80%以上，表现出强效杀螨活性。对于手性化合物，大多数S-型异构体的杀螨活性等于或高于其R-型异构体。具体而言，化合物I-4、I-7和I-9的S-型异构体活性变化显著，其杀螨活性可达R-型异构体的20倍以上。不过，I-7和I-9的S-型异构体本身活性并不突出。而化合物I-1、I-2、I-3、I-8、I-13、I-15和I-16的两种对映体活性没有显著变化。虽然多个S-构型化合物比其R-构型对应物更活跃，但数据也显示它们与其外消旋体的活性并无实质性差异。综合考虑杀螨活性水平和合成成本，外消旋体rac-I-1被选作最有价值的候选杀螨剂进行深入研究。

对非靶标生物的活性

为了对候选分子进行更准确的风险评估，研究人员研究了典型手性化合物对水生生物的影响。结果显示，I-1外消旋体及其两种对映体对大型溞（D. magna）均表现为中等毒性，对羊角月牙藻（P. subcapitata）表现为低毒性。在95%置信区间内，对映体与外消旋体对两种水生生物的毒性均无显著差异。这为选择外消旋体I-1作为候选杀螨剂提供了积极的数据支持。

体外几丁质合成酶抑制活性

为了确认这类化合物的作用机制，研究人员选择了两个代表性化合物I-1和I-10，评估了它们对体外表达的土耳其斯坦叶螨几丁质合成酶1（TuCHS1）的抑制效果。数据显示，乙螨唑以及I-1和I-10的两种对映体对TuCHS1均具有抑制活性，且表现出浓度依赖性。与体内杀螨活性的结果一致，这两种化合物的S-型异构体比R-型异构体表现出略高的抑制率。该研究基本证明了此类化合物的杀螨机制与乙螨唑一致。

对乙螨唑抗性螨卵的杀螨活性测试

为了进一步确定其杀螨机制，研究人员还测试了其对乙螨唑抗性土耳其斯坦叶螨（T. urticae）卵的杀螨活性。数据显示，包括rac-I-1、R-I-1和S-I-1在内的化合物对抗性螨卵的致死率较低，EC₅₀值高于10 mg/L，表明这些化合物与乙螨唑存在交互抗性。

分子对接

为了更深入地理解上述化合物的分子作用机制，研究人员建立并分析了几丁质合成酶1与乙螨唑及I-1对映体之间的分子对接模型。对接结果显示，I-1的两种对映体与乙螨唑在活性口袋中占据几乎相同的位置。R-I-1和S-I-1与TcCHS1的结合亲和力分别为-10.1和-10.4 kJ/mol，尽管没有氢键存在。类似地，化合物R-I-4和S-I-4也能以高结合亲和力（分别为-9.5和-10.1 kJ/mol）与同一口袋结合。对接结果验证了早期的三维定量构效关系研究，表明在4-苯基位置引入大体积疏水基团有助于保持杀螨活性，这为未来基于噁唑啉的新型杀螨剂设计提供了理论基础。不过值得注意的是，结合亲和力并不总是与活性水平呈正相关，因为生物酶中的结合口袋并非刚性空腔。

研究结论与重要意义

本研究对16对2,4-二苯基噁唑啉对映体针对螨卵的杀螨活性进行了系统比较。研究结果表明，大多数化合物的S-型异构体活性略高于或类似于其相应的R-型异构体。尽管S-型异构体在某些化合物中显示出更高的体外酶抑制活性和分子对接结合亲和力，但综合考虑杀螨活性水平、生产成本以及对非靶标水生生物（大型溞和羊角月牙藻）的活性，研究人员认为外消旋体rac-I-1是比其单一S-型异构体更具潜力的候选杀螨剂。

在机制层面，通过分子对接、抗性螨活性测试和体外几丁质合成酶1抑制活性测定等多重证据链，本研究确认了该系列化合物的杀螨机制与乙螨唑相同，同为几丁质合成酶1（CHS1）抑制剂。分子对接还揭示了活性口袋中存在一个较大的疏水空腔，为未来设计新型几丁质合成抑制剂提供了明确的结构指导。

这项研究的意义在于，它不仅为开发新型手性杀螨剂提供了关键的数据和理论支持，更重要的是，它展示了一种理性、全面的农药候选物评估思路：在追求高活性的同时，必须综合考虑对映体差异、合成成本、环境安全性与作用机制。尤其是在全球面临农药抗性日益严峻的背景下，针对已验证靶点（如CHS1）进行结构创新和优化，是发现新一代高效、低风险杀螨剂的有效策略。本研究为未来基于噁唑啉结构的杀螨剂和几丁质合成酶1抑制剂的设计与合成奠定了坚实的基础，指明了方向。当然，要将rac-I-1或其他候选化合物最终开发为商用杀螨剂，仍有大量的田间药效、环境归趋、毒理学和制剂化等工作有待完成，这些将是未来研究逐步展开和报告的内容。