《Advances in Biological Regulation》：Adrenergic receptor activation shapes circadian clock gene oscillations in HL-1 cardiomyocyte cell line
编辑推荐：
心脏生物钟基因节律受肾上腺素受体调控的机制研究。采用血清冲击同步的HL-1心肌细胞模型，通过激活α和β肾上腺素受体，发现其对Per1/2/3等核心生物钟基因的振幅、相位和节律产生差异调控作用，为体外研究心脏时序调控提供新模型。
Elena Crecca|Martina Pinna|Maria Rita Assenza|Andrea M. Isidori|Federica Barbagallo
罗马智慧大学解剖学、组织学、法医学与骨科科学系，意大利罗马
摘要
昼夜节律是具有24小时周期的生理、生物化学和行为过程，这些过程由时钟基因在分子层面进行调控。心血管生理学受到心率、血压和收缩力的昼夜变化影响，以根据休息-活动阶段优化其功能。肾上腺素能受体（ARs）在调节心脏功能中起着关键作用；然而，可用于体外研究心肌细胞内在昼夜节律的模型仍然有限，且这些模型对系统时间线索的依赖性较低。在本研究中，我们使用了HL-1心肌细胞系（HL-1细胞），在这种细胞中，血清冲击可以诱导核心时钟基因转录本的同步振荡，而在非同步培养条件下则无法实现这种振荡。我们在不同条件下对HL-1细胞施加了不同的AR激动剂，并测量了代表性时钟基因的昼夜振荡情况。研究结果表明，α-和β-AR的激活会以不同的方式调节时钟基因的振幅和相位。这些发现支持HL-1细胞作为研究肾上腺素能信号传导与心肌细胞时钟基因振荡之间相互作用的便捷体外平台。
引言
日常的时间系统为心脏生理学提供了时间组织，使基因表达、代谢、离子处理和应激反应与可预测的昼夜需求保持一致（Koronowski和Sassone-Corsi，2021；Paranjpe和Sharma，2005）。对重复且可预测的刺激产生适当的时间反应，意味着存在一个内源性且自我维持的生物钟，该生物钟能够根据外部信号（也称为zeitgebers）进行同步/调整。与细胞的自主性一致，几乎所有器官和细胞中都检测到了昼夜节律钟，包括所有类型的心血管细胞（Yoo等人，2004；Zhang等人，2014）。在分子层面，细胞时钟机制由一组时钟基因维持，形成了大约24小时的转录/翻译反馈循环（TTFLs）。在24小时周期的开始阶段，异二聚体复合物CLOCK/BMAL1与Period circadian蛋白同源物1-3（Per1, Per2, Per3）、Cryptochrome 1-2（Cry1和Cry2）、Reverse-erythroblastosis病毒（Rev-erbα/β）、Retinoic acid受体相关孤儿受体α/β（Rorα/β）以及数千个受时钟调控的基因（CCG）启动子区域中的E-box元件结合，从而促进这些基因的转录（正反馈）。转录后，PER和CRY蛋白在细胞质中逐渐积累，形成异二聚体并转移到细胞核中，在那里直接抑制CLOCK/BMAL1的活性，从而随时间降低时钟基因的转录速率（负反馈）（Dunlap，1999）。清除PER和CRY蛋白是启动新的转录周期所必需的（Takahashi，2017）。此外，TTFLs还包括核受体REV-ERB α/β和ROR α/β，它们分别抑制或促进Bmal1的转录（Guillaumond等人，2005；Yin和Lazar，2005）。
在哺乳动物中，除了细胞的自主计时功能外，神经激素输入还对外周时钟进行调控。在下丘脑的视交叉上核（SCN）中的中央主时钟通过神经激素信号，将全身独立的外周时钟同步起来，从而实现统一的时间（Reppert和Weaver，2002）。
心血管系统在生理和病理条件下都受到昼夜节律的调节。事实上，心脏时钟基因会影响心率、血压和收缩力的波动，这些指标在休息阶段和活动阶段之间存在差异（Leibetseder等人，2009；Young等人，2001）。交感神经系统通过β1/β2-肾上腺素能受体（β-ARs）调节心肌细胞的功能。内源性儿茶酚胺的激活能够根据身体需求调整心肌细胞的收缩力（Perez，2021；Wang等人，2021；West等人，2019）。肾上腺素能信号传导表现出显著的日间波动性，并被认为与心血管事件的晨间高峰有关，这激发了研究肾上腺素能张力如何调节心脏时钟的机制（Nuszkiewicz等人，2025）。
从机制上看，β-ARs与腺苷酸环化酶（AC）结合，产生cAMP并激活蛋白激酶A（PKA），后者磷酸化CREB以驱动含有CRE的启动子。多项证据表明cAMP/PKA/CREB是时钟基因的强大调节因子：佛斯高林（forskolin，直接激活AC）可诱导Per1/Per2并在成纤维细胞中引发昼夜振荡（Yagita和Okamura，2000）；cAMP对哺乳动物昼夜节律的进展至关重要（O'Neill等人，2008）；PER2与p-CREB协同作用，有助于在CRE元件处诱导Per1（Brenna等人，2021）。这些数据共同表明，肾上腺素能–cAMP信号传导可以改变时钟基因振荡的振幅和相位。
使用原代心肌细胞为研究心脏内部昼夜节律的固有特性（Durgan等人，2005）以及ARs与时钟基因之间的直接联系（Jesus等人，2021）提供了重要证据，然而，不同肾上腺素能操作对基因的具体影响及其对细胞同步状态的依赖性在心肌细胞系中仍不明确。
HL-1心肌细胞系（HL-1细胞）提供了一个易于操作的体外系统，能够保留许多分化的心脏特征（Claycomb等人，1998），并广泛用于在受控环境中研究信号传导–转录耦合机制。在本研究中，我们通过比较未同步的HL-1细胞和经血清冲击同步的HL-1细胞，检验了β-ARs/cAMP激活是否以状态依赖的方式调节心肌细胞的昼夜振荡器。我们的发现明确了肾上腺素能–cAMP对心脏时钟网络的调控点，这对心血管生物学中的时间调控策略具有重要意义。
部分内容摘录
细胞培养
HL-1细胞（Sigma-Aldrich，美国加州）在37°C和5% CO2条件下培养，使用Claycomb培养基（Sigma Aldrich，美国加州），培养基中添加了10% v/v胎牛血清（FBS）（Sigma Aldrich，美国加州）、0.2 mM去甲肾上腺素、2 mM L-谷氨酰胺、1 U/ml青霉素和1 μg/ml链霉素（Sigma Aldrich，美国加州），具体操作方法如Claycomb等人（1998）所述。
HL-1细胞同步及药物处理
当HL-1细胞达到85%至100%的汇合度时，移除所有培养基。用PBS清洗细胞后重新更换培养基
血清冲击同步后，HL-1细胞显示出功能性转录分子时钟机制
HL-1是一种成熟的心肌细胞系，其在增殖过程中仍保持分化的心脏表型（Claycomb等人，1998）。这些细胞可以长期培养而不影响其特性。基于此，我们试图验证血清冲击（SS）同步是否能够诱导出自主且自我维持的时钟基因表达，如图1所示。Clock和Bmal1的表达通过qRT-PCR进行检测
讨论
昼夜节律在行为、生理和病理过程中的重要作用引发了人们对相关分子时钟机制的日益关注。鉴于时钟机制的普遍存在，已经开发出多种方法来研究特定组织或细胞环境中时钟基因的作用，例如条件性时钟基因敲除小鼠模型。心肌细胞昼夜节律在调节心肌生理学中的作用至关重要
CRediT作者贡献声明
Elena Crecca：撰写初稿、方法学设计、实验实施。Martina Pinna：数据验证、方法学验证、数据分析。Maria Rita Assenza：数据验证、实验实施。Andrea M. Isidori：撰写稿件、审稿与编辑、实验监督。Federica Barbagallo：撰写稿件、审稿与编辑、实验监督、资金申请、数据管理、概念构思。
数据可用性声明
本研究中的原始数据已包含在文章中。如有进一步疑问，请联系相应作者。
资助
本研究得到了大学与研究部的资助，资助编号为PRIN2022 PNRR P2022W7ALA，资助对象为FB。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
