《Bioactive Materials》：3D-MSCs apoptotic bodies-integrated conductive hydrogel mitigates spinal cord injury via immunoregulation and alleviating neuronal pyroptosis
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本研究针对脊髓损伤(SCI)后炎症微环境失衡和神经元死亡等关键病理过程，开发了一种整合MXene纳米片的导电GelMA水凝胶递送系统，用于负载3D培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的凋亡囊泡(3D-ABs)。研究证实该复合水凝胶能有效激活PI3K/AKT通路，缓解氧化应激，促进巨噬细胞M2极化，抑制神经元焦亡(pyroptosis)，显著改善SCI小鼠的运动功能恢复，为脊髓损伤修复提供了新的治疗策略。
脊髓损伤(SCI)是一种毁灭性的中枢神经系统疾病，全球影响着数百万人，且发病率呈上升趋势。当脊髓遭受创伤后，不仅会造成直接的机械性损伤，更会引发一系列复杂的继发性病理反应，包括剧烈的炎症反应、氧化应激以及各种形式的神经元死亡，这些因素共同导致神经功能几乎不可逆的丧失，给患者、家庭和社会带来沉重的负担。目前，临床上的标准治疗方案，如减压手术和大剂量激素冲击，往往只能阻止损伤的进一步恶化，而无法有效促进神经再生和功能恢复。细胞移植虽然展现出潜力，但面临着免疫排斥和疗效短暂等挑战。因此，开发能够有效调控损伤微环境、保护神经元并促进神经再生的新型治疗策略，成为脊髓损伤修复领域亟待突破的关键科学问题。
在这一背景下，生物材料，特别是水凝胶，因其能模拟细胞外基质(ECM)、具有良好的生物相容性和可注射性，被视为极具前景的载体工具。其中，明胶甲基丙烯酰(GelMA)水凝胶因其优异的生物活性和可调控的物理性质备受关注。与此同时，电传导是神经元之间信息交流的基础，因此，赋予水凝胶导电性能，使其能够模拟神经组织的电生理环境，对于促进神经修复具有重要意义。MXene作为一种新兴的二维过渡金属碳化物或氮化物，以其卓越的导电性和生物相容性，在组织工程中展现出巨大潜力。
另一方面，干细胞疗法，尤其是骨髓间充质干细胞(BMSCs)疗法，因其强大的免疫调节和旁分泌功能，在脊髓损伤治疗中备受青睐。然而，直接移植干细胞存在定植率低、存活时间短等问题。近年来，研究发现干细胞发挥治疗作用的关键机制之一是通过释放细胞外囊泡(EVs)，特别是凋亡过程中产生的凋亡囊泡(ABs)。这些囊泡携带了母细胞的多种生物活性物质（如蛋白质、miRNA等），能够参与细胞间通讯，且免疫原性较低。更有趣的是，研究表明，与传统二维(2D)培养相比，三维(3D)培养的细胞（如形成细胞球体）能表现出更强的生物活性和治疗潜力，其产生的凋亡囊泡内容物也可能发生改变，从而具有更优的治疗效果。
基于以上背景，来自温州医科大学附属第二医院骨科的研究团队在《Bioactive Materials》上发表了一项创新性研究，他们巧妙地将3D培养的BMSCs来源的凋亡囊泡(3D-ABs)与导电的MXene纳米片共同整合到GelMA水凝胶中，构建了一种兼具生物活性与导电功能的复合水凝胶(AMG)。研究人员设想，这种复合水凝胶在注射到脊髓损伤区域后，不仅能填充损伤空洞、提供机械支撑，其导电成分能模拟神经电信号传导，而持续释放的3D-ABs则能精准调控损伤局部的免疫微环境，抑制有害的炎症反应和神经元死亡，从而为神经再生创造有利条件。
为验证这一设想，研究团队运用了多项关键技术方法。他们首先通过悬浮培养获得3D-BMSC球状体，并诱导其凋亡后采用超速离心法分离纯化3D-ABs，利用动态光散射(DLS)、扫描电镜(SEM)、蛋白质印迹法(WB)等手段对其进行了表征。通过化学蚀刻法合成了MXene纳米片，并利用SEM和能量色散X射线光谱(EDS)进行了表征。将3D-ABs和MXene与含有光引发剂的GelMA前体溶液混合，经紫外光(UV)交联形成AMG复合水凝胶，并系统评估了其微观结构、导电性、流变学性能、压缩模量、溶胀率、降解速率及囊泡释放曲线。研究建立了小鼠T10水平脊髓半切损伤模型，并将不同组别的水凝胶（如不含MXene的AG、不含ABs的MG以及完整的AMG）局部注射至损伤区域。通过行为学评分（Basso Mouse Scale, BMS）、足迹分析、运动诱发电位(MEPs)以及视频运动分析评估功能恢复。利用组织学染色（苏木精-伊红染色, HE；Masson染色）、免疫荧光染色、蛋白质印迹法(WB)、酶联免疫吸附试验(ELISA)以及实时定量聚合酶链式反应(qPCR)等技术，在体外（使用PC12细胞、BV2小胶质细胞、原代神经元和巨噬细胞）和体内分析了水凝胶对氧化应激、巨噬细胞/小胶质细胞极化（M1/M2表型）、神经元焦亡、星形胶质细胞极化（A1/A2表型）、轴突再生和髓鞘修复的影响。此外，还通过转录组测序(RNA-seq)及基因集富集分析(GSEA)探索了潜在的分子机制，并利用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002进行了挽救实验以验证通路的关键作用。
2.1. AMG水凝胶的制备与表征
研究人员成功通过悬浮培养获得了具有良好活性的3D-BMSC球状体，并从中分离出粒径约700纳米的3D-ABs，其表达典型的凋亡囊泡标志物（C1QC、C3B、H2B、H3）。体外实验证明，这些3D-ABs能高效地被神经元模型PC12细胞和小胶质细胞模型BV2细胞以及原代神经元和巨噬细胞内化。同时，成功合成了具有典型二维层状结构的MXene纳米片。将3D-ABs（最佳浓度1.25 mg/mL）和MXene纳米片（200 μg/mL）整合入GelMA水凝胶，经UV交联后形成了具有多孔结构的AMG复合水凝胶。表征结果显示，MXene的加入显著提高了水凝胶的导电性（AMG组电导率约为1.57 S/m），并影响了其力学性能（降低了压缩模量和储能模量）和溶胀行为。3D-ABs能在6天内从水凝胶中持续释放超过90%。体外生物相容性实验表明，该复合水凝胶对多种细胞均无显著毒性。
2.2. AMG水凝胶的生物相容性
通过体外与PC12、BV2、原代神经元和巨噬细胞共培养，以及体内皮下植入实验，证实了AMG水凝胶具有良好的生物相容性，对小鼠主要器官未见明显病理损伤，各项生理指标正常。
2.3. AMG水凝胶有效改善SCI后小鼠的组织学和功能表现
在脊髓损伤后第28天，组织学评估显示，AMG水凝胶治疗显著减少了损伤空洞的形成。行为学评估（BMS评分、足迹分析）和运动诱发电位(MEP)记录均表明，AMG治疗组小鼠的后肢运动功能恢复最为显著，其步态、关节活动度、肌肉萎缩程度均得到明显改善。详细的后肢运动视频分析进一步证实了AMG组在运动协调性和支撑力方面的优势。
2.4. AMG水凝胶的作用机制
转录组测序分析揭示了AMG水凝胶治疗组与单纯SCI组之间存在253个差异表达基因。KEGG通路富集分析提示，神经活性配体-受体相互作用、PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路和神经营养因子信号通路可能参与其中。Western blot结果证实，AMG处理能显著提高损伤脊髓组织中磷酸化PI3K(p-PI3K)和磷酸化AKT(p-AKT)的水平，表明其通过激活PI3K/AKT通路发挥作用。GO分析进一步表明，AMG水凝胶可能通过影响氧化应激、轴突发生、焦亡和炎症反应等生物学过程促进修复。
2.5. AMG水凝胶在体外和体内抑制氧化应激
在体外，使用叔丁基过氧化氢(TBHP)模拟氧化应激环境，发现AMG水凝胶能显著降低PC12和BV2细胞内的活性氧(ROS)水平。在体内，脊髓组织切片二氢乙啶(DHE)染色显示，AMG治疗组损伤区域的ROS水平明显低于SCI组。GSEA分析也为AMG缓解氧化应激提供了支持。通过使用PI3K抑制剂LY294002的挽救实验证实，AMG水凝胶抑制氧化应激炎症微环境的作用依赖于PI3K/AKT通路的激活。
2.6. AMG水凝胶在体外促进巨噬细胞极化并减少神经元焦亡
在TBHP诱导的炎症环境下，AMG水凝胶能显著促进BV2小胶质细胞和原代巨噬细胞向抗炎的M2表型极化（表现为Arg-1和CD206表达上调，iNOS和CD86表达下调）。在氧糖剥夺(OGD)模拟的损伤条件下，AMG水凝胶能有效减轻PC12细胞和原代神经元的死亡。Western blot分析显示，AMG处理显著降低了焦亡关键蛋白（NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N、ASC、IL-18、IL-1β）的表达，表明其能有效抑制神经元焦亡。
2.7. AMG水凝胶在体内抑制炎症反应并促进巨噬细胞极化
在脊髓损伤后第3天，AMG水凝胶治疗显著减少了损伤区域的炎症细胞（CD68+细胞）浸润，并降低了促炎细胞因子IL-1β和IL-18的水平。免疫荧光和Western blot结果一致表明，AMG水凝胶能有效促进体内的巨噬细胞/小胶质细胞向M2表型极化。挽救实验再次证明，这一促进作用是通过激活PI3K/AKT通路实现的。
2.8. AMG水凝胶在体内减少神经元焦亡，促进神经元存活
损伤后第3天的组织学分析显示，AMG治疗组脊髓前角存活的神经元（NeuN+）数量多于SCI组。同时，免疫荧光和Western blot结果证实，AMG水凝胶能显著抑制损伤区域内神经元中Caspase-1和GSDMD-N的表达，以及其它焦亡相关蛋白的水平，表明其有效缓解了SCI后的神经元焦亡。PI3K通路抑制剂的实验表明，AMG水凝胶抑制神经元焦亡的作用也依赖于PI3K/AKT通路。
2.9. 复合水凝胶促进SCI后星形胶质细胞极化
研究还发现，AMG水凝胶能促进星形胶质细胞向神经保护性的A2表型（S100A10+）极化，同时抑制其向神经毒性的A1表型（C3+）极化，这一效应同样与PI3K/AKT通路的激活有关。
2.10. 复合水凝胶增强体内轴突再生和髓鞘再生
在损伤后第28天，通过免疫荧光染色评估长期的修复效果。结果显示，AMG治疗组损伤区域内神经丝蛋白200(NF200)阳性的再生轴突数量显著增加，同时髓鞘碱性蛋白(MBP)阳性的髓鞘再生也得到促进，表明AMG水凝胶为轴突再生和髓鞘修复提供了有利的微环境。GSEA分析也支持其在促进轴突再生方面的作用。
本研究成功开发了一种新型的、兼具导电特性（通过MXene实现）和生物活性（通过3D-BMSCs来源的凋亡囊泡实现）的复合水凝胶系统。该水凝胶通过多种机制协同作用，有效促进了脊髓损伤后的功能恢复：其一，填充损伤空洞，提供物理支撑和利于神经再生的三维结构；其二，其导电成分模拟神经电信号传导环境；其三，持续释放的3D-ABs通过激活PI3K/AKT信号通路，有效缓解了损伤早期的氧化应激，促进了巨噬细胞/小胶质细胞向有益的M2表型极化，并显著抑制了神经元焦亡这一关键的炎症性死亡方式；其四，在损伤后期，该水凝胶还能促进星形胶质细胞向A2表型极化，并支持轴突再生和髓鞘修复。
该研究的创新之处在于将3D培养技术应用于增强治疗性囊泡的活性，并将导电纳米材料与活性囊泡递送系统相结合，构建了“物理支撑-电信号模拟-生物活性调控”一体化的治疗策略。这不仅为脊髓损伤的修复提供了新的思路和潜在的治疗工具，也为其他神经退行性疾病或组织损伤的治疗策略设计带来了启示。当然，该研究也存在一些局限性，例如对3D-ABs中具体哪些成分（如特定miRNA或蛋白质）发挥关键作用尚未深入解析，水凝胶的长期导电性维持和药物释放动力学也有待进一步优化。未来的研究可聚焦于工程化改造凋亡囊泡的内容物，实现更精准的靶向治疗，并将该策略在更接近临床现实的脊髓挫伤模型中进行验证，推动其向临床转化迈出更坚实的步伐。
