将扩增的胆道树干细胞类器官进行补片移植以修复胆管损伤

《Biomaterials》：Patch Grafting of Expanded Biliary Tree Stem Cell Organoids to Rescue Bile Duct Injury

【字体：大中小】 时间：2026年02月06日 来源：Biomaterials 12.9

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　　胆管干细胞（BTSCs）通过BEX-gel系统高效扩增并分化为胆管细胞器官（BTSC-ChOs），其功能通过罗丹明123转运和钙信号验证。移植BTSC-ChOs到胆管损伤小鼠模型中成功修复胆管，且胆酸（TβMCA、TCA）表达谱可作为疗效监测指标。本研究为胆管损伤治疗提供了新型细胞来源。

上海交通大学生命科学与技术学院、上海东医院心血管疾病国家重点实验室、医学创新中心与再生医学研究所，中国上海200123

摘要

胆管树干细胞（BTSCs）具有向肝胆和胰腺分化的潜力，是修复胆管损伤的理想细胞。此前，我们建立了一种用于扩增BTSC类器官的BTSC扩增水凝胶（BEX-gel）系统，并开发了一种贴片移植策略来输送BTSC类器官以治疗肝损伤和糖尿病。在本研究中，我们重点关注了扩增后的BTSC类器官生成功能性胆管细胞的能力及其修复胆管损伤的效果。

我们构建了一种胆管细胞分化系统，该系统包括基质和无血清的Kubota培养基，并添加了FGF2、VEGF165、HGF、TGF-β1、Jagged-1、视黄酸（RA）和Forskolin，以及Cu(2+)和Ca(2+)，以诱导扩增后的BTSC类器官在7天内形成胆管细胞。通过RNA测序比较了BTSCs、BTSC衍生的分支胆管细胞类器官（BTSC-ChOs）和成熟的鼠胆管细胞（mCHOs）。RNA-seq结果显示，BTSC-ChOs中的胆管细胞标志物Sctr、Ae2、Ggt1和Tgr5的基因表达显著上调。功能检测（包括罗丹明-123转运和细胞内钙水平）表明BTSC-ChOs具有与mCHOs相似的特性。

将BTSC类器官通过贴片移植策略移植到因DDC饮食和MDA腹腔注射导致胆管损伤的动物体内后，这些细胞在体内成熟为功能性胆管细胞，从而修复了胆管。进一步分析治疗前后初级胆汁酸的表达水平发现，牛磺β-牛胆酸（TβMCA）和牛磺胆酸（TCA）对移植细胞的胆管修复效果非常敏感，因此可作为监测胆管损伤治疗效果的理想指标。本研究表明，扩增后的BTSC类器官是治疗与胆管损伤相关疾病的理想细胞来源。

引言

肝外胆管是胆汁从胆囊排入十二指肠的唯一通道。临床上，肝外胆管疾病如先天性胆道闭锁（CBA）、医源性胆管损伤（IBDI）、胆管阻塞或肿瘤可能导致胆管损伤或丧失，进而引发肝硬化甚至危及生命的疾病。尽管现在可以通过胆管空肠吻合术治疗某些问题，但完全恢复胆管的正常功能仍然是一个重大挑战。在某些情况下，胆管上皮细胞（BDECs）或胆管细胞可能增殖以再生或修复肝或胆管损伤。如果剩余的胆管细胞不足以完成修复，胆管细胞移植或干细胞移植可能是解决这一临床问题的有效方法。高质量的移植胆管细胞还可以作为人工胆管重建的功能性细胞，这在胆管手术中非常需要。

胆管细胞具有多种功能，包括分泌和吸收、损伤修复以及免疫屏障功能。激活后，它们会释放多种肽类物质和介质，通过旁分泌作用参与并调节肝内的病理生理过程。此外，胆管细胞还能调节胆管中的液体、电解质和溶质，并在胆汁酸的形成和循环中起关键作用。在肝脏中，肝细胞主要负责代谢和胆汁生成，而胆管细胞则在胆管中起保护和调节作用。胆管细胞的异常与许多肝脏疾病的发展和进展有关，包括急性和慢性肝损伤、肝炎、肝纤维化、胆汁淤积和肝肿瘤。

人们已尝试利用胆管细胞修复胆管；先前的研究在使用iPSC衍生的胆管上皮类器官的多种模型中取得了有希望的结果。例如，Sampaziotis及其同事从人类诱导多能干细胞（iPSCs）中分离出了类似胆管细胞的细胞（CLCs），并利用其良好的胆管细胞特性生成了用于药物筛选的疾病模型。基于这项研究的改良系统可以直接从分离出的原代胆管细胞生成功能性胆管细胞类器官（ChOs）。这些ChOs不仅能够修复胆管损伤模型，还能在胆管阻塞的肝移植候选者中显著促进胆管再生和重塑。

我们的研究专注于使用成体干细胞修复肝脏和胆管。胆管树干细胞（BTSCs）是存在于胆管壁周围腺体中的成体干细胞，具有分化为肝实质细胞（肝细胞、胆管细胞）和胰腺细胞（胰岛细胞和腺泡细胞）的能力。迄今为止，我们已经建立了无血清培养系统，从包括人类、猪和小鼠在内的多种哺乳动物的胆管树中分离并扩增BTSCs（EpCAM⁺ Sox17⁺ CK19⁺）。通过结合细胞外基质和特定的可溶性信号（生长因子），可以在体外诱导BTSCs分化为肝细胞、胆管细胞和胰岛细胞。

同时，利用一种新的贴片移植策略，将BTSC类器官移植到突变小鼠的肝脏或胰腺上，成功挽救了患有酪氨酸血症（肝脏）或I型糖尿病（胰腺）的动物。这些研究表明，BTSCs在肝病和胰腺疾病的治疗中具有巨大的临床应用潜力。

为了确保有足够的细胞用于临床应用，我们还开发了一种BTSC水凝胶（BEX-gel）系统来扩增BTSC类器官。该系统由五种小分子和生长因子（Forskolin、A8301、RG108、Bay K 8644和R-spondin1）组成的5D增殖培养基（5DPM）组成。5DPM可以使BTSC类器官长期扩增至20代，数量稳定增加约3000倍。此外，我们还证明扩增后的BTSCs仍保留分化为成熟肝细胞的能力，从而可以修复缺乏fumarylacetoacetate hydrolase（Fah^-/-）的小鼠的肝损伤。基于这些发现，本研究旨在探讨扩增后的BTSCs是否也可以作为修复胆管损伤、替代受损胆管细胞的候选细胞。我们开发了一种胆管细胞分化系统，可以从扩增后的BTSC类器官生成分支胆管细胞类器官（BTSC-ChOs），并在体外和体内功能测试中证明了这些BTSC-ChOs用于胆管修复和治疗的可行性。这项研究为基于移植扩增BTSC类器官的胆管损伤治疗提供了范例。

节选内容

来自肝外胆管的可扩增BTSC类器官与成体胆管细胞不同

比较了从鼠肝外胆管组织（包括胆囊）分离出的BTSCs与从鼠肝内胆管（IHBDs）分离出的成熟胆管细胞（mCHOs）或成熟胆管上皮细胞（mBDECs）的特征（图1A）。初次培养的BTSCs在粘附后表现出典型的上皮前体形态，呈小型圆形细胞（图1A和S1A）。在类器官（3D）培养扩增后，BTSC类器官能够达到一定的直径

讨论

胆管损伤是最具挑战性的临床疾病之一，基于干细胞的治疗和组织工程可能是最佳的治疗方法。由于胆管树干细胞（BTSCs）具有向肝胆和胰腺谱系分化的潜力，因此是实现这一目标的理想候选细胞。在本研究中，我们成功利用了之前开发的BTSC类器官体外扩增系统，并通过特定分化条件生成了所需的细胞类型

公司

Abcam（英国剑桥）；Accurate Biology（中国浙江）；Advanced BioMatrix（美国卡尔斯巴德）；Bio Gems（美国加利福尼亚）；Biosharp（爱沙尼亚塔林）；北京福bio生物技术有限公司（中国北京）；Beyotime生物技术有限公司（中国上海）；Corning（美国纽约）；Beckman Counter Life Sciences（美国印第安纳）；EZBioscience（美国罗斯维尔）；Gibco（中国上海）；Leica Biosystems（德国努斯洛赫）；MCE（美国蒙茅斯琼斯）；MXB（中国福州）；Peprotech（美国克兰伯里）；

CRediT作者贡献声明

Jiaqi Lin：验证、研究。Mengqi Lu：验证、方法学。Jinjia Song：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。Wei Dai：验证、研究、数据管理。Wencheng Zhang：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、监督、资源管理、项目协调、方法学、研究、资金获取，

利益声明

作者声明没有利益冲突。

竞争利益声明

? 作者声明以下可能被视为潜在竞争利益的财务利益/个人关系：Wencheng Zhang、Zhiying He和Jinjia Song拥有待授权给上海交通大学的专利。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文所述工作的竞争利益或个人关系。

致谢

本项工作得到了中国国家自然科学基金（编号：82270638、82472691）对Wencheng Zhang的支持；中国国家自然科学基金（编号：82173019、82203741、82471592）、上海细胞治疗临床研究中心（项目编号：23J41900100）、上海高等教育机构的重点学科（第四类）以及上海干细胞转化医学工程研究中心（项目编号：20DZ2255100）对Zhiying He的支持。

Lijun Liao得到了上海2023年的资助