《Biomaterials》：Titanium-Guided Neutrophil Dynamics for Inflammation Resolution and Tissue Integration
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本研究采用大动物模型，通过单细胞RNA测序分析钛植入物周围免疫微环境，发现中性粒细胞主导的动态过程：通过NF-κB信号释放化学趋化因子招募间充质干细胞，并诱导中性粒细胞凋亡释放外泌体促进成骨分化，最终实现高效骨整合。
王飞宇|林伟民|刘林峰|陈伟昌|吴磊|宋伟|何万林|尹琦|邢马尔科姆|袁全
四川大学华西口腔医院口腔疾病国家重点实验室、国家口腔医学中心、国家口腔疾病临床研究中心，中国成都610041
摘要
大多数合成植入物会引发异物反应，导致设备被密集的纤维化囊包裹，阻碍与周围组织的紧密结合。相比之下，钛能够直接与骨头结合并实现长期的临床功能。目前尚不清楚钛界面最初的免疫信号是如何引导炎症向快速消退和促进再生的方向发展，从而最大化植入物的组织整合性和功能表现的。在本研究中，我们通过单细胞RNA测序技术分析了钛植入物周围的早期免疫微环境，发现中性粒细胞在细胞动态中起主导作用。与标准组织愈合过程相比，中性粒细胞的招募更早，清除也更快；在小鼠中，中性粒细胞的缺失显著影响了植入物的整合。钛植入物能激活中性粒细胞的NF-κB信号通路，促使趋化因子释放，吸引间充质干细胞（MSCs），同时诱导中性粒细胞凋亡；这些凋亡细胞释放的细胞外囊泡（EVs）进一步增强了MSCs的成骨能力。这些发现为生物材料与组织的相互作用提供了宝贵的见解，并为优化植入物设计和临床结果奠定了基础。
引言
异物的植入通常会引发典型的异物反应，其特征是先天免疫反应驱动的纤维化以及形成密集的胶原囊，这会隔离生物材料，阻碍组织整合[1]、[2]、[3]。相比之下，钛植入物通过骨整合实现了直接结合，而没有纤维化包裹，这是其在骨科和牙科应用中取得无与伦比临床成功的原因[4]。尽管已有数十年的临床证据，但钛如何避免纤维化包裹并实现直接骨整合的细胞和分子机制仍不完全清楚。植入后的初始炎症阶段对组织整合结果至关重要：过度的促炎信号会导致纤维化包裹，而及时的炎症消退则有利于再生过程[5]、[6]。研究表明，钛植入物能够主动调节局部免疫微环境，在植入后的最初几周内诱导植入物周围的免疫激活[7]。通过使用克洛德隆酸脂质体或转基因模型中的基因敲除方法耗尽巨噬细胞会破坏植入物周围的细胞因子环境，减少白细胞和间充质基质细胞的招募，最终影响组织整合[8]。然而，大多数研究仅提供了生物材料植入后复杂异物反应的快照视图[9]、[10]；特别是在具有临床相关性的模型中，对植入物周围免疫动态的全面、时间分辨的分析仍然很少。
单细胞转录组学（scRNA-seq）的发展已成为探索体内细胞异质性、细胞功能和细胞间通讯的有效工具[11]、[12]。例如，早期在生物材料研究中的应用评估了宿主对植入小鼠肌肉组织的可吸收材料的反应[13]。最近的研究表明，肌肉损伤后植入细胞外基质（ECM）材料可以促进BATF3依赖的CD103+XCR1+CD206+CD301b+树突状细胞群体的扩张，从而创建一个再生的免疫微环境[14]。同样，骨植入物的成功整合也与免疫系统和基质细胞之间的动态相互作用有关。整合的单细胞和空间转录组学进一步证明，高表达Mgp的间充质干细胞（MSCs）具有高效的成骨分化潜力，并协调植入生物材料周围的免疫微环境[15]。具体到钛，小鼠模型中的scRNA-seq研究表明，钛纳米颗粒会由于髓系细胞的招募而在周围组织中诱导慢性炎症和免疫抑制环境。然而，尽管小鼠模型具有实用性，但其较短的愈合周期和不同的炎症过程限制了将其结果直接应用于人类组织的推论[16]。相比之下，大型动物模型的组织整合周期和免疫反应更接近人类，因此非常适合研究这一复杂过程。然而，对大型动物模型中骨整合过程中的细胞动态进行全面系统的单细胞分析尚未开展[17]。
在这项研究中，我们使用了一个具有临床相关性的大型动物模型，进行了scRNA-seq分析以了解钛植入物的周围反应。植入后，中性粒细胞迅速浸润并启动了一个由NF-κB调控的程序，包括早期通过趋化因子招募MSCs，随后通过细胞外囊泡（EVs）释放促进成骨。我们的发现揭示了一种新的机制，即钛植入物能够精确调节中性粒细胞的动态和炎症消退，从而促进骨整合，并为下一代可植入生物材料的设计提供了时间分辨的参考。
动物模型
巴马迷你猪（中国成都四川镇农业有限公司饲养）在标准条件下饲养。Rosa26-LSL-tdTomato小鼠和Prrx1-Cre小鼠来自杰克逊实验室。Prrx1-Cre; tdTomato小鼠是通过将Rosa26-LSL-tdTomato小鼠与Prrx1-Cre小鼠杂交获得的。所有小鼠都饲养在无特定病原体（SPF）环境中，温度为20–25°C，相对湿度为50–70%，光照/黑暗周期为12小时。所有动物实验均获得批准并在该环境中进行。
scRNA-seq揭示动态的免疫细胞浸润
为了阐明钛植入物早期骨整合的细胞动态，我们对手术后第1天、第3天和第7天从猪下颌采集的植入物周围组织进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），并以简单的下颌损伤部位作为对照（图S2A）。样品通过10x Genomics Chromium平台进行酶解处理，生成单细胞悬浮液（图1A）。经过质量控制（图S2B）后，共获得了33,926个高质量细胞
讨论
植入物的骨整合过程通常包括从血液与材料相互作用到成功骨整合或纤维化包裹的多个阶段[30]。由于迷你猪在解剖学、生理学和免疫学上与人类相似，因此比小鼠等小型哺乳动物更为适用，因为在新骨形成方面可以在损伤后第7天就观察到明显变化[16]。我们的猪模型显示，在植入物周围主要是修复性肉芽组织
CRediT作者贡献声明
陈伟昌：撰写 – 审稿与编辑，研究。
林伟民：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，可视化，方法学，研究，资金获取，正式分析，数据管理。
吴磊：撰写 – 审稿与编辑，研究。
刘林峰：撰写 – 审稿与编辑，研究，正式分析，数据管理。
何万林：撰写 – 审稿与编辑。
宋伟：撰写 – 审稿与编辑，研究。
邢马尔科姆：撰写 – 审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（资助编号：82125006、823B2018）、四川省自然科学基金（资助编号：2025ZNSFSC0055、2026NSFSC1571）、四川大学华西口腔医院的研究与发展计划（资助编号：LCYJ-ZD-202502）以及中国博士后科学基金（资助编号：GZC20251216）的支持。
