基于CRISPR技术的荧光条形码微球指数级扩增方法，用于深度学习辅助的多重HPV检测

《Biosensors and Bioelectronics》：CRISPR-Initiated Exponential Amplification on Fluorescently-Barcoded Microspheres for Deep Learning-Assisted Multiplexed HPV Detection

【字体：大中小】 时间：2026年02月06日 来源：Biosensors and Bioelectronics 10.7

编辑推荐：

　　CRISPR-Cas9结合量子点编码微珠和深度学习算法实现HPV16、HPV18、HPV33的高灵敏度多重检测，检测限低至0.2 pM，通过引物裂解和指数扩增简化流程，适用于资源有限的地区近患者检测。

白婷婷|曲晓军|潘金顺|唐玉珍|王卢海|周平|胡振珍|郭志瑞|朱叶飞|张宇

南京医科大学第二附属医院实验室医学中心，中国南京210011

摘要

快速、低成本且多重的核酸检测对人类健康至关重要，但仍然具有挑战性。尽管CRISPR-Cas系统具有高特异性，但将其整合到适用于近患者检测的多重检测平台中的程度仍然有限。在这里，我们介绍了一种生物传感平台，该平台结合了CRISPR诱导的酶促扩增、量子点编码的微珠和基于深度学习的图像分析，用于多重检测人乳头瘤病毒（HPV）DNA。CRISPR/Cas9的高特异性首先触发指数级扩增，然后产物被特异性地捕获在微珠表面进行局部荧光读取。一种定制的深度学习算法自动量化微珠的荧光，实现了稳健和自动化的分析。这种集成方法能够同时检测HPV16、HPV18和HPV33，检测限低至0.2 pM。通过使用识别触发的扩增和简单的深度学习辅助荧光读取，工作流程得到了显著简化。该平台为分子诊断建立了一种通用且实用的战略，显示出在近患者检测中的强大潜力。

引言

核酸检测已成为现代医学诊断中的基础技术，在全球健康安全、疾病监测和临床管理中发挥着越来越重要的作用。近期全球健康危机凸显了对快速、经济高效且多重病原体检测方法的需求。（Kaminski等人，2021年；van Dongen等人，2020年；Wang等人，2020年）对于呼吸道感染，区分SARS-CoV-2、流感病毒等对于适当的临床管理和感染控制非常有帮助（Bian等人，2024年；Patchsung等人，2020年；Xiong等人，2021年；Ye等人，2025年）。同样，准确识别和亚型分类人乳头瘤病毒（HPV）对于癌症风险分层和预防干预也至关重要（Xu等人，2022年）。世界卫生组织发起的宫颈癌消除计划进一步强调了在高发病率和资源匮乏环境中进行可及、准确的多重HPV检测的迫切需求。（组织，2022年）

自聚合酶链反应（PCR）技术最初开发以来，核酸检测领域发生了巨大变化。（Schmittgen和Livak，2008年）到目前为止，下一代测序（NGS）代表了全面病原体检测的当前金标准，能够从临床样本中识别已知和新的病原体。（Gu等人，2021年）然而，由于需要昂贵的设备、复杂的操作、缓慢的结果和高成本，这些方法在常规诊断测试中受到了严重限制。为了解决这些限制，出现了等温扩增技术，如环介导的等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）、链置换扩增（SDA）和解旋酶依赖性扩增（HDA）（Wei等人，2022年）。选择这些方法时必须权衡灵敏度、特异性、简单性和成本之间的平衡。

CRISPR-Cas系统（规律间隔短回文重复序列和CRISPR相关蛋白）似乎是满足高灵敏度核苷酸检测需求的理想选择。CRISPR效应子包括Cas9、Cas12a和Cas13a/b，已与各种检测模块结合，形成了基于CRISPR的核酸诊断技术，因为它们具有高特异性。（Liu等人，2025年；Tang等人，2021年）尽管取得了这些进展，但在实现稳健的多重检测能力方面仍存在挑战。首先，为了克服基于PCR方法的局限性，引入了RPA作为预扩增过程，使得在低至1 aM的浓度下也能检测到DNA底物（Feng等人，2025年；Wang等人，2020年）。这些预扩增方法依赖于多种酶、特殊试剂和复杂的引物设计，定义了检测灵敏度和特异性的限制，从而阻碍了CRISPR独特识别特异性的有效利用（Wang等人，2019年）。最近的创新尝试通过使用发夹探针激活Cas12来避免预扩增，这代表了在保持高灵敏度的同时简化检测架构的一个独特方向（Chen等人，2025年；Lim等人，2025年；Moon等人，2025年）。其次，大多数当前的基于CRISPR的检测平台虽然能够检测单一目标，但缺乏进行稳健的多目标检测的能力。这些平台主要依赖于Cas酶的附带切割活性，这使得在单个管中难以区分多个目标。为了克服这一限制，像SHERLOCKv2这样的策略利用了具有不同报告特异性的多个Cas酶，这增加了复杂性并引发了潜在交叉反应的担忧（Gootenberg等人，2018年；Kellner等人，2019年）。在多重检测方面的挑战在HPV检测中尤为明显，因为HPV有超过100种不同的亚型，至少有14种已知的高风险类型（组织，2022年；Xu等人，2022年）。目前在临床实践中，诊断重点主要放在HPV16和HPV18上，这两种类型占全球宫颈癌病例的约70%。因此，迫切需要开发一种简单且全面的HPV多重检测方法，以实现经济高效的大规模筛查。

最近的创新主要集中在整合多种技术以克服这些限制。等温后扩增步骤与CRISPR介导的检测相结合，在检测低丰度目标方面显示出高灵敏度（Kaminski等人，2021年）。同样，通过荧光微球、光子晶体或在微流控设备中的空间编码，引入条形码策略为实现真正的多重检测提供了有希望的途径（Xu等人，2022年；Zhang等人，2021年；Zhang等人，2025年）。特别是基于量子点的条形码方法由于其狭窄的发射光谱和光稳定性而在多重检测中具有明显优势（Guo等人，2017年）

在这项工作中，我们提出了一种名为CRISPR-诱导指数扩增在条形码微球（CRISPR-EAB）上的多重HPV检测集成生物传感平台。它结合了CRISPR-Cas9识别与等温指数扩增（iEXPAR），随后在量子点条形码聚苯乙烯微球（Qbeads）上进行分支杂交链反应（B-HCR）。这允许在同一管中同时检测HPV16、HPV18和HPV33。基于StarDist神经网络的深度学习辅助图像分析模块自动化了Qbeads的分割和荧光量化。该平台将精确识别、高效扩增、多重检测和智能分析集成到一个简化的 workflow 中，为资源匮乏地区的简单多重HPV检测提供了强大的工具。

实验试剂和材料

实验中使用了以下试剂：10 μm大小的羧基化聚苯乙烯微球（PS微球，ZHONGKELEIMING，中国）；蓝光发射的ZnCds/ZnS量子点（发射波长：450 nm）和绿光发射的CdSe/ZnS量子点（发射波长：520 nm）（Xingzi，中国）；四乙基正硅酸盐（TEOS，99.999%），氨（NH₃·H₂O，28 wt%），(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APS，97%），琥珀酸酐（99%），N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐晶体（EDC），N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠

多重HPV检测平台原理

多重HPV检测平台的原理如图1所示。该过程从可编程的目标HPV双链DNA的解旋和切割开始。首先，sgRNA与Cas9结合，形成CRISPR RNP复合物。在sgRNA的引导下，RNP复合物定位并结合到互补的双链DNA目标上，激活Cas9的切割活性。切割精确发生在PAM位点上游的第三个和第四个核苷酸之间的磷酸二酯键处

结论

总之，我们开发了一个稳健的、通用的近患者检测平台，该平台将CRISPR-Cas系统与Qbeads和DL辅助成像模块相结合，实现了无需复杂实验室基础设施的多重HPV DNA检测。该平台基于市售的PS微球和量子点构建。量子点的多样性和光稳定性荧光特性促进了多重条形码的可扩展合成，而成熟的供应链确保了其

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

作者贡献声明

王卢海：验证。周平：数据管理。潘金顺：方法学、研究。唐玉珍：数据管理。白婷婷：撰写——原始草稿、方法学、研究、资金获取、概念化。曲晓军：方法学、研究。张宇：资源、资金获取、概念化。朱叶飞：资源、方法学、资金获取。胡振珍：验证。郭志瑞：正式分析