《Cancer Genetics》：Context-Specific Roles of DDX60 in Colorectal Cancer via Autophagy Regulation and DDX58 Signaling
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本研究聚焦DDX60在结直肠癌(CRC)中的矛盾角色，通过体外/体内模型揭示其通过调控自噬和DDX58信号通路，在缺乏免疫压力的体外环境中促进肿瘤恶性表型，而在复杂肿瘤微环境体内则激活先天免疫、诱导凋亡并抑制肿瘤生长，为理解DDX60的情境依赖性功能及靶向自噬-免疫轴治疗CRC提供了新视角。
结直肠癌是全球范围内发病率和死亡率均位居前列的消化道恶性肿瘤，其发生发展涉及复杂的分子机制。近年来，DEAD-box（DDX）RNA解旋酶家族在肿瘤生物学中的作用日益受到关注，然而其中DDX60在结直肠癌中的功能仍不明确，且现有研究表明其在不同肿瘤类型中可能扮演着相反的角色，这种功能异质性很可能与自噬和先天免疫信号通路相关。因此，深入探究DDX60在结直肠癌中的具体作用及其调控机制，对于揭示该疾病的发病机理和寻找新的治疗靶点具有重要意义。
为了阐明DDX60在结直肠癌中的生物学功能，研究人员Kai Wang、Chenyang Zhang等来自滨州医学院医院结直肠肛门外科的团队在《Cancer Genetics》上发表了他们的研究成果。他们综合利用了转录组测序(RNA-seq)、蛋白质印迹(WB)等技术分析了DDX60在结直肠癌细胞系中的表达谱。通过慢病毒转导技术，在SW620细胞中实现了DDX60的过表达(OE-DDX60)和敲低(KD-DDX60)，并利用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、5-乙炔基-2‘-脱氧尿苷(EdU)掺入、划痕愈合和Transwell实验评估了其对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。通过免疫荧光染色检测微管相关蛋白1A/1B-轻链3B(LC3B)和 sequestosome 1 (p62/SQSTM1)的水平，以评估自噬活性。采用免疫共沉淀(Co-IP)实验评估了DDX60与DExD/H-box解旋酶58(DDX58，也称为RIG-I)之间的相互作用。此外，还利用商业试剂盒定量了脂质过氧化产物和炎症细胞因子，并通过JC-1染色评估了线粒体膜电位。在体内实验中，研究人员将SW620细胞皮下注射到裸鼠腹股沟区建立异种移植瘤模型，监测肿瘤重量和体积，并利用苏木精-伊红(H&E)染色和流式细胞术分析肿瘤组织的组织学变化和细胞凋亡情况。
表达谱分析揭示DDX60在CRC细胞系中的表达
研究人员首先通过RNA-seq分析了DDX家族基因在正常结肠上皮细胞NCM460和结直肠癌细胞系（Caco2、LoVo、SW620）中的表达谱。结果显示，多种DDX基因呈现不同的表达模式。值得注意的是，与NCM460细胞相比，DDX58、DDX60和DDX60L在CRC细胞系中的mRNA表达水平显著降低。然而，随后的WB蛋白水平分析却显示，DDX60和DDX60L蛋白在CRC细胞系中的表达反而高于NCM460细胞，提示可能存在转录后调控机制。鉴于这种复杂性，研究选择DDX60作为后续深入研究的焦点。
DDX60在体外促进SW620细胞的增殖、迁移和侵袭
通过功能获得和功能缺失实验，研究证实了DDX60对SW620细胞恶性表型的促进作用。OE-DDX60显著增强了细胞的活力、增殖（EdU阳性细胞比例增加）、迁移（划痕愈合能力增强）和侵袭（Transwell侵袭细胞数增加）能力，同时抑制了细胞凋亡。相反，KD-DDX60则产生了相反的效果。这些表型变化与上皮-间质转化(EMT)标志物N-钙黏蛋白和β-连环蛋白的表达变化一致，OE-DDX60上调了这两种蛋白的表达。在基础DDX60表达水平更高的Caco2细胞中进行的补充实验也验证了DDX60对细胞侵袭的促进作用。
DDX60通过自噬途径调控细胞功能并与DDX58相互作用
机制探索发现，OE-DDX60显著上调了LC3-II/I比值、自噬相关基因5(ATG5)、ATG7和Beclin-1的表达，并降低了p62的表达，表明其激活了自噬通路。使用自噬抑制剂氯喹(CQ)处理后，OE-DDX60组LC3-II的积累更为明显，提示自噬流增强。此外，OE-DDX60还降低了p62-Ser403磷酸化水平和K48连接的多聚泛素化蛋白水平，表明其促进了自噬底物的降解。重要的是，OE-DDX60显著上调了DDX58的蛋白表达水平，而Co-IP实验证实了DDX60与DDX58之间存在直接的蛋白质相互作用。然而，在体外条件下，DDX60的过表达或敲低并未显著改变线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)和干扰素-α(IFN-α)的蛋白水平，提示DDX60对DDX58的调控可能不依赖于经典的下游MAVS/I型干扰素通路，或者该通路在体外条件下已达到激活饱和。
自噬抑制剂CA-5f的抗肿瘤效应
使用晚期自噬抑制剂CA-5f处理细胞后，LC3B和p62蛋白水平增加。CA-5f处理显著降低了SW620细胞的活力，并诱导了细胞凋亡，表现为凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)下调、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和 cleaved Caspase-3 上调。这些结果表明，抑制DDX60激活的自噬通路能够发挥抗肿瘤作用。
DDX60通过自噬调控脂肪酸代谢、氧化应激和炎症
进一步研究发现，OE-DDX60降低了细胞内游离脂肪酸(FFA)水平，增加了脂肪酸氧化(FAO)活性，并减少了脂质过氧化产物丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)和4-羟基壬烯醛(4-HNE)的生成。同时，OE-DDX60还抑制了肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-1β等促炎细胞因子的分泌，并增强了线粒体膜电位。而KD-DDX60和CA-5f处理则产生了相反的效果，导致FFA积累、FAO抑制、脂质过氧化加剧、促炎因子水平升高以及线粒体功能受损。为了确认这些效应依赖于自噬通路，研究进行了挽救实验。在OE-DDX60的基础上，利用小干扰RNA(siRNA)敲低关键自噬基因ATG5(si-ATG5)，成功逆转了OE-DDX60对脂质过氧化和促炎细胞因子分泌的抑制作用，明确证实了自噬通路的核心地位。
DDX60在体内表现出抑瘤作用并与CA-5f协同
与体外实验结果相反，在裸鼠异种移植瘤模型中，OE-DDX60显著抑制了肿瘤的生长，表现为肿瘤体积和重量减小，肿瘤细胞密度降低，而细胞凋亡率增加。KD-DDX60则轻微促进了肿瘤生长。组织学分析和流式细胞术检测进一步证实了OE-DDX60的促凋亡作用。令人关注的是，在体内环境下，OE-DDX60显著上调了肿瘤组织中DDX58、MAVS和IFN-α的蛋白表达水平，并且小鼠血清中的IFN-α和IFN-β水平也相应升高，表明DDX60在体内有效激活了DDX58/MAVS/IFN轴先天免疫信号通路。自噬抑制剂CA-5f在体内同样表现出强烈的抗肿瘤效果，显著抑制肿瘤生长并促进凋亡。
DDX60和CA-5f对体内自噬、氧化应激和炎症的影响
体内免疫荧光分析显示，OE-DDX60增强了肿瘤组织中的自噬活性（LC3B斑点增多）。然而，与体外结果不同，OE-DDX60在体内导致肿瘤组织中MDA、ROS、4-HNE等脂质过氧化产物水平显著升高，同时TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎细胞因子水平也大幅增加，呈现出促氧化和促炎症的表型。CA-5f处理也观察到了类似的自噬抑制、氧化应激加剧和炎症增强的效果。
研究结论与意义
本研究系统地揭示了DDX60在结直肠癌中具有情境依赖性的双重功能。在缺乏免疫压力的体外培养环境中，DDX60通过激活自噬、维持脂质代谢稳态、降低氧化应激和稳定线粒体功能，扮演了促进肿瘤细胞存活和恶性进展的角色。然而，在包含复杂基质和潜在免疫细胞影响的体内肿瘤微环境中，DDX60则通过激活DDX58介导的先天免疫信号通路，诱发强烈的炎症反应和氧化应激，进而抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡。这种功能转换凸显了肿瘤微环境在决定基因功能中的关键作用。
该研究的创新性在于首次报道了DDX60在结直肠癌体外和体内模型中的相反作用，并将这种双重功能与自噬调控、DDX58信号通路、脂质代谢重编程和线粒体功能紧密联系起来。研究结果表明，DDX60及其下游效应分子（如DDX58、自噬相关蛋白、脂质代谢标志物等）有望成为结直肠癌预后判断或治疗反应监测的潜在生物标志物。特别是其在体内激活先天免疫的能力，提示高表达DDX60的肿瘤可能对免疫检查点抑制剂等免疫疗法更敏感。此外，靶向“DDX60-自噬轴”可能成为一种新的治疗策略，例如将自噬抑制剂（如CA-5f）与常规化疗联合使用，有望克服肿瘤的代谢适应并提高治疗敏感性。
当然，本研究也存在一些局限性，如主要使用单一细胞系（SW620）、体内模型采用免疫缺陷小鼠未能完全模拟人体免疫微环境、对DDX60-DDX58轴激活的直接因果证据仍需加强等。未来的研究需要在免疫健全模型、更接近生理的结直肠癌模型（如ApcMin/+小鼠、原位移植模型）中进一步验证，并利用基因编辑、代谢组学等技术深入阐明其精确分子机制，推动其向临床转化。总之，该研究为理解结直肠癌的复杂调控网络提供了新的重要见解，并为开发新的治疗策略奠定了基础。
