《Cellular Signalling》：ADAM12-programmed ECM-CAF remodeling activates PI3K–AKT and enforces an immune-excluded microenvironment to drive bladder cancer progression and therapy resistance
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本研究针对膀胱癌中肿瘤相关成纤维细胞（CAF）介导的基质重塑导致免疫排斥及治疗抵抗的机制不清问题，通过整合单细胞转录组、GWAS和TCGA/GEO数据，结合WGCNA、药物反应预测及体内外实验，发现ECM-CAF亚群浸润与ADAM12和TP53偏斜基底样程序上调显著相关。ADAM12通过激活PI3K–AKT–mTOR通路促进膀胱癌增殖、迁移、侵袭及免疫抑制微环境形成，敲低ADAM12可抑制肿瘤生长和肺转移。该研究为基质靶向干预和膀胱癌精准治疗提供了新靶点和策略。
膀胱癌是全球第十大常见癌症，2020年新发病例约57.3万例，死亡21.3万例。尽管手术和系统性治疗取得进展，肌层浸润性和转移性膀胱癌的预后仍不理想，许多患者治疗后出现复发或疾病进展。免疫检查点抑制剂在富含基质的基底样膀胱癌中疗效有限，这类肿瘤常伴随TP53突变和癌症相关成纤维细胞（CAF）的显著浸润。研究表明，CAF的存在与肿瘤侵袭性和免疫治疗效果相关，它们通过修饰细胞外基质（ECM）、释放生长因子和细胞因子，形成化学和物理屏障，抑制免疫细胞杀伤肿瘤细胞，并降低药物疗效。因此，探究CAF及其相关基质调控因子在膀胱癌发生发展中的作用具有重要意义。
为深入探索CAF在膀胱癌中的作用及相关基质调控因子，研究人员采用scPagwas方法整合单细胞转录组数据与GWAS结果，识别出与膀胱癌进展密切相关的CAF亚群及微环境相关驱动基因。研究发现，ADAM金属肽酶结构域12（ADAM12）在这一过程中发挥关键作用。ADAM12是一种膜结合金属蛋白酶，通过其蛋白水解功能调节细胞外环境，在正常组织中表达较低，而在伤口愈合组织、纤维组织和多种恶性肿瘤中表达显著升高。ADAM12过表达与肿瘤侵袭性增强、化疗耐药和不良预后密切相关，但其在膀胱癌发生发展中的具体作用尚不清楚。
本研究利用GEO数据库的膀胱癌组织单细胞RNA测序数据，通过scPagwas整合分析GWAS数据与单细胞转录组数据，发现ECM-CAF是与膀胱癌进展密切相关的CAF亚群，ADAM12是其主要的基质调控因子。通过分析TCGA和GEO数据集中膀胱癌患者的转录组数据，评估了ADAM12表达与临床特征的相关性。采用多重免疫荧光标记技术分析膀胱癌患者组织样本，探讨ADAM12与ECM-CAF在膀胱癌发生发展中的关联。研究还分析了与ADAM12表达相关的免疫细胞和基质成分，利用药物反应预测模型分析ADAM12对个体治疗敏感性的影响，并通过细胞和动物模型的体内外验证实验证实了ADAM12的功能。
研究人员应用多种关键技术方法开展研究。数据来源于TCGA和GEO数据库的膀胱癌基因组数据及单细胞RNA测序数据集。临床样本包括从武汉大学人民医院采集的膀胱癌标本及配对癌旁组织。单细胞RNA测序分析采用Seurat R软件包进行质控、标准化和细胞聚类注释。通过scPagwas整合单细胞RNA测序与GWAS数据，计算性状相关评分（TRS）。采用GSVA进行基因集变异分析，WGCNA构建加权基因共表达网络，GSEA进行基因集富集分析。利用CIBERSORT和ESTIMATE算法评估肿瘤微环境免疫细胞组成和基质/免疫评分。通过pRRophetic预测药物反应，并使用maftools进行突变分析。细胞实验涉及膀胱癌细胞系和原代CAF的培养、siRNA转染、病毒感染、qRT-PCR、Western blotting、CCK-8、细胞迁移侵袭实验等。动物实验建立了裸鼠异种移植模型和C57BL/6小鼠同系肿瘤模型，评估肿瘤生长、转移及免疫细胞浸润。组织学分析采用免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）技术。
3.1. 单细胞转录组分析揭示膀胱癌微环境的显著异质性
通过单细胞转录组分析，研究人员在膀胱癌微环境中识别出上皮细胞、内皮细胞、髓系巨噬细胞、T/NK淋巴细胞、B淋巴细胞和多个CAF亚群。CAF可进一步分为ECM-CAF、肌样CAF（myCAF）、炎症相关iCAF、干扰素反应性IFN-CAF、增殖相关Cycling-CAF等亚型。不同患者间的细胞组成存在显著差异，为后续通路激活、微环境特征与临床表型相关性分析提供了重要框架。
3.2. scPagwas分析膀胱癌相关CAF
基于单细胞通路GWAS富集分析（scPagwas），发现膀胱癌相关遗传信号在多个细胞类型中分布不均，在特定肿瘤基质和上皮亚群中显著富集。ECM-CAF的高TRS与较差的生存结局相关，而myCAF的高TRS则与较好的生存相关。这表明来自微环境/细胞类型的基因富集信号可在整体水平转化为稳健的预后指标。
3.3. ECM-CAF高肿瘤呈现晚期、侵袭性特征及免疫通路重塑
ECM-CAF TRS高的肿瘤表现出以基质程序为主的表达谱，其TRS值与肿瘤分期、浸润深度、转移状态呈正相关。在免疫通路层面，ECM-CAF高的肿瘤显示抗原加工提呈、趋化因子信号、白细胞介素受体信号和TGF-β超家族成员等多个免疫相关通路发生系统性重塑，提示其更易获得免疫抑制和免疫逃逸表型。
3.4. ECM-CAF高肿瘤显示免疫逃逸特征和广泛耐药性
ECM-CAF高的肿瘤表现出免疫功能障碍和免疫排斥：TIDE总分、T细胞功能障碍和排斥评分显著升高，尽管CD8+T细胞估计丰度较高，但伴随更高的排斥评分，呈现"量多无效"的免疫忽视状态。药物反应预测显示，ECM-CAF高的肿瘤对多种靶向和化疗药物均呈现耐受趋势。基因组学分析表明，低TRS组更富集上皮/乳头状谱系特征突变（如FGFR3），而高TRS组更倾向于TP53及相关通路突变。
3.5. 共表达网络揭示ECM-CAF模块及与不良生存相关的枢纽基因
通过WGCNA构建加权共表达网络，发现MElightyellow模块与ECM-CAF评分显著正相关。取"ECM-CAF正相关模块基因集"、"ECM-CAF特征基因集"和"ECM-CAF高低组差异基因集"的交集，获得15个核心基因，这些基因主要编码胶原、基质重塑因子和金属蛋白酶，围绕"胶原-基质重塑-蛋白酶"轴形成功能核心。生存分析显示，ADAM12等高表达与较差预后显著相关。
3.6. ADAM12在膀胱癌中上调且是不良预后的独立预测因子
TCGA/GTEx泛癌数据分析显示，ADAM12在大多数实体瘤中显著升高，膀胱癌中的上调尤为突出。配对样本中，肿瘤组织的ADAM12转录水平持续高于配对正常膀胱组织。多变量Cox回归显示，ADAM12是不良结局的独立风险因素。实验验证表明，多数膀胱癌细胞系中ADAM12蛋白显著增加，临床标本中肿瘤组织ADAM12蛋白高于对应正常组织。
3.7. ADAM12敲低抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭
通过慢病毒介导的shRNA在T24和UMUC3细胞中靶向沉默ADAM12，实现高效敲低。功能实验表明，ADAM12缺陷显著减弱细胞增殖能力，克隆形成数量减少，伤口愈合受阻，迁移和侵袭能力下降。
3.8. ADAM12过表达增强膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭
建立稳定过表达细胞系，证实ADAM12转录和蛋白水平显著增加。功能上，过表达组细胞活力/增殖率增强，克隆形成数量增加，伤口愈合加速，迁移和侵袭能力显著提升。
3.9. ADAM12共表达揭示协调的ECM重塑和PI3K–AKT–mTOR激活
ADAM12高表达肿瘤中一组ECM基质相关基因显著上调。GSEA结果显示，ADAM12高表达肿瘤在ECM-受体相互作用、黏着斑和PI3K–AKT信号通路显著富集。在T24和UMUC3细胞中，ADAM12敲低显著降低PI3K、AKT、mTOR和S6K的磷酸化，而过表达则增强这些节点的磷酸化。原代CAF中ADAM12表达高于正常成纤维细胞，ADAM12沉默降低ECM蛋白输出，ADAM12沉默CAF的条件培养基显著抑制膀胱癌细胞增殖、克隆形成及迁移侵袭，并减弱PI3K–AKT–mTOR级联通路的激活。
3.10. ADAM12高肿瘤呈现免疫抑制微环境且伴随免疫原性降低
ESTIMATE分析显示，ADAM12高表达肿瘤的基质评分和免疫评分显著较高。CIBERSORT分析揭示，ADAM12高的肿瘤富含免疫抑制细胞（M2巨噬细胞、M0巨噬细胞、静息肥大细胞），而ADAM12低的肿瘤具有相对较高的效应淋巴细胞。多重免疫荧光证实ADAM12高肿瘤中M2样巨噬细胞增加，CD8+T细胞显示更高的PD-1+比例和降低的GZMB+细胞毒性CD8+T细胞比例，支持T细胞功能障碍/耗竭表型。免疫表型评分（IPS）表明ADAM12高肿瘤的免疫原性降低。
3.11. ADAM12在体内驱动肿瘤生长、转移和PI3K–AKT–mTOR信号
在裸鼠异种移植模型中，ADAM12过表达膀胱癌细胞产生显著更大的肿瘤，而敲低细胞产生较小肿瘤。在免疫健全的C57BL/6-MB49同系肿瘤模型中，ADAM12过表达加速肿瘤生长，敲低抑制肿瘤进展。多重IF染色表明ADAM12激活促进免疫抑制环境， characterized by M2样巨噬细胞极化增强，细胞毒性效应特征减弱。尾静脉肺转移模型中，ADAM12过表达细胞形成更多更大的肺转移瘤，敲低显著降低肺转移负荷。免疫组化分析显示，ADAM12过表达肿瘤中Ki-67增殖指数和磷酸化PI3K、AKT、mTOR、S6K水平上调，敲低肿瘤中这些信号下调。
研究结论与讨论部分强调，ADAM12作为基质驱动因子，连接了基质重塑、PI3K-AKT信号通路和膀胱癌免疫抑制，具有良好的预后和治疗分层潜力。其在ECM-CAF亚群中显著富集，与去分化表型、侵袭性增强、免疫抑制微环境和不良临床结局密切相关。共表达分析揭示了以ADAM12为中心、富含ECM成分和蛋白酶的功能模块，该模块在ADAM12高肿瘤中协同激活，与生存期显著缩短相关。
在免疫生态位方面，ADAM12高/ECM-CAF富集肿瘤呈现"免疫排斥/功能障碍"特征：整体免疫和基质评分升高，但T细胞功能障碍和排斥信号共存；免疫检查点分子协同上调；免疫抑制细胞富集，而细胞毒性淋巴细胞效应受限。这与致密ECM和活化CAF形成物理/化学屏障，阻碍效应细胞浸润和功能的模型一致。
机制上，ADAM12可能通过正向调控PI3K–AKT–mTOR轴促进肿瘤细胞存活和增殖：其可与β1-整合素和ILK在黏着斑形成复合物促进Akt激活；其金属蛋白酶活性可切割IGFBP或释放EGF样配体增强IGF-1R/EGFR信号，从而连接PI3K/Akt和MAPK通路；TGF-β也可能通过PI3K/p70S6K通路诱导ADAM12表达，提示潜在正反馈循环。
在药物敏感性方面，ADAM12高/ECM-CAF富集肿瘤表现出广谱耐药表型。鉴于ADAM12主要由基质细胞合成，它既可通过内在信号（PI3K-AKT）增强肿瘤细胞适应性，也可通过外在基质重塑和免疫抑制加重治疗抵抗。
ADAM12具有"双重价值"——潜在治疗靶点和生物标志物。其胞外金属蛋白酶结构域和去整合素/半胱氨酸富集区为小分子或抗体药物提供可行结合位点。通路水平的替代策略包括：在ADAM12高表达人群评估PI3K、AKT、mTOR抑制剂；将免疫检查点抑制剂与基质重塑药物（如TGF-β抑制剂、FAP靶向方案）联合以去除纤维化屏障，恢复T细胞浸润。作为标志物，ADAM12高表达与较短的无进展生存期和总生存期独立相关；将其纳入分层模型可提高5年生存预测准确性。
该研究也存在局限性，主要基于转录组关联和体外验证。ADAM12的蛋白酶依赖性/非依赖性功能及其与整合素-ILK复合物和生长因子轴的因果链仍需在空间组学和可控体内模型中精细解析。药物预测需结合药代动力学/药效学及前瞻性队列验证。ADAM12位于ECM重塑-CAF激活-PI3K-AKT信号-免疫逃逸轴的关键枢纽，协同增强肿瘤生长、侵袭和治疗抵抗。有效控制基质致密膀胱癌可能需要肿瘤细胞直接杀伤与TME重塑相结合的策略。ADAM12因此是一个值得优先验证的基质导向治疗靶点和临床分层标志物。
