《Current Opinion in Biomedical Engineering》：Next generation technologies for CRISPR-based epigenome and transcriptional modulation
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表观基因组编辑技术通过CRISPR-Cas系统调控染色质修饰和转录，为基因功能研究及治疗提供新工具。本文综述了新型工具开发（如CRISPRi/a、合成转录因子）、高通量筛选方法及疗效评估，指出其安全性和靶向性仍需优化。
Rithu K. Pattali|Nikita S. Divekar|James K. Nu?ez
加州大学伯克利分校分子与细胞生物学系，美国加利福尼亚州伯克利，邮编94720
摘要
用于编辑哺乳动物细胞中的表观遗传修饰和控制转录的技术彻底改变了靶向基因干扰、功能基因组学和基础研究。由于避免了DNA断裂的产生，表观基因组编辑成为一种安全且精确的改变基因表达的平台，并已成为治疗应用的有希望的工具。CRISPR的出现显著扩展了用于编程调节表观遗传和转录状态的工具箱。本综述重点介绍了通过合理设计、高通量筛选方法和突变扫描工程化新型表观基因组编辑和转录调节工具的最新发现，这些方法利用了内源性染色质和转录效应因子来实现靶向基因抑制和激活。我们还讨论了表观基因组调节剂的治疗潜力，并强调了需要解决的关键挑战，以提高其安全性和有效性。加深对驱动基因表达的复杂机制的理解并克服当前的局限性，将为开发推进基础研究和转化应用的新技术铺平道路。
引言
基因组编辑技术的迅速发展促进了用于基础研究和治疗应用的基因组干扰技术的发展。特别是，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）- CRISPR相关蛋白（Cas）核酸酶、碱基编辑器和重组酶等工具，极大地提高了以高精度和可编程性重写哺乳动物细胞基因组的能力（1）。与基因组编辑工具的发展并行的是，基于CRISPR的技术的创新，这些技术通过调节哺乳动物细胞中的表观遗传修饰来控制基因表达，而不是诱导DNA断裂或改变宿主基因组序列。表观基因组编辑技术已被广泛用于靶向转录抑制和激活基因、功能基因组学研究，以及最近作为干扰疾病相关基因的潜在治疗手段（2, 3）。
靶向表观基因组编辑的平台依赖于一个DNA结合模块（例如TALE、锌指蛋白、CRISPR-Cas），并结合一个表观遗传调节剂，该调节剂可以酶促编辑表观遗传修饰（例如DNA或组蛋白甲基转移酶或乙酰转移酶），或者作为支架蛋白招募内源性表观遗传和/或转录调节因子（例如转录共抑制因子和共激活因子）（图1）。例如，将催化失活的dCas9与新的DNA甲基转移酶复合物Dnmt3a-Dnmt3l结合，可以在导向基因启动子时直接在CpG二核苷酸处添加DNA甲基化，从而导致目标基因的长期、可遗传的转录沉默（4, 5）。相反，将dCas9与TET1 DNA去甲基化酶融合后靶向基因启动子，可以去除基因启动子处的DNA甲基化，从而重新激活被这种表观遗传标记沉默的基因（6）（图1a）。尽管表观基因组编辑在CRISPR出现之前就已经被描述过，但RNA引导的Cas蛋白的可编程性质极大地推进了这些技术在哺乳动物细胞中的应用。
在本综述中，我们使用“表观基因组编辑”一词来描述通过招募染色质相关效应因子并随后改变目标位点的表观遗传景观来调节基因表达的可编程方法。例如，一些效应因子可以酶促催化表观遗传变化，如沉积DNA甲基化标记的DNA甲基转移酶（DNMTs）（5），以及启动DNA甲基化去除的TET1（6）。此外，一些效应因子间接作为支架蛋白起作用，例如已经得到很好研究的KRAB结构域，它作为支架招募KAP1共抑制因子以促进抑制性染色质修饰，包括H3K9me3（7）。相比之下，转录激活因子如VP64或VPR主要通过与转录机制（包括RNA聚合酶II和共激活因子复合物）的直接相互作用来发挥作用。虽然这些转录效应因子可以强烈调节基因表达，但它们通常不会在目标位点诱导稳定或可遗传的表观遗传修饰。尽管这两类效应因子通常被归类在更广泛的CRISPRa/i框架下，但它们在机制、持久性和对内源性染色质维持途径的依赖性方面存在显著差异。关于直接和间接表观基因组编辑模式之间的机制差异的详细讨论可以在最近的综述中找到（8）。
表观基因组编辑技术在真核细胞中的一个直接用途是用于位点特异性的转录抑制（CRISPR干扰或CRISPRi）或激活（CRISPRa）。最先进的CRISPRi平台将dCas9与锌指蛋白家族中的Krüppel相关盒（KRAB）结构域结合，后者可以招募表观遗传抑制蛋白在目标基因启动子处建立H3K9me3，最终导致转录抑制（9, 10）。自CRISPRi问世以来，它已成为一种变革性技术，相比核酸酶或RNAi基基因沉默方法具有优势。例如，CRISPRi不会伴随DNA断裂相关的细胞毒性，并且可以诱导完全渗透性的沉默，而核酸酶可能导致异质性和不可预测的DNA修复结果。另一个进展是实验性地筛选和计算预测具有高效CRISPRi活性的sgRNA，这产生了针对哺乳动物基因的高活性sgRNA和用于功能基因组学的紧凑型sgRNA文库（11）。因此，CRISPRi/a技术已被广泛应用于体外和体内小鼠模型，并推动了单细胞CRISPR干扰方法（如Perturb-seq和CROP-seq）的发展（12, 13, 14）。
最近，该领域取得了重大突破，发现了新的转录抑制因子和激活因子，可以在哺乳动物细胞中调节基因表达。这些研究的核心目标是扩大转录调节的基因靶向范围，并理解表观基因组调节剂对转录的直接影响。例如，通过将KRAB结构域与表观遗传调节剂MeCP2结合，可以进一步增强其功能（15）。在这里，我们回顾了最近发现下一代转录抑制因子和激活因子的研究，这些因子扩展了用于调节哺乳动物细胞表观基因组和基因表达的工具箱。我们还讨论了表观基因组调节剂的安全性和治疗应用的最新进展。最后，我们指出了这一快速发展的领域中的挑战和未来方向。
部分摘录
利用高通量筛选发现新的表观基因组工程工具
参与真核细胞染色质调节的蛋白质提供了丰富的效应因子来源，这些效应因子可以用来构建用于调节基因表达的合成工具。早期发现新的转录编辑效应因子的努力依赖于低通量克隆和在阵列格式中测试单个dCas9融合体。尽管这种策略产生了诸如DNA甲基化修饰因子和来自ZNF10的KRAB结构域等强大的转录抑制工具（9）
组合合成抑制因子增强可编程基因抑制
哺乳动物的表观遗传调控是一个高度复杂的过程，涉及大型多蛋白复合物的协调。对于表观基因组编辑，先前的研究表明，将具有不同生化功能的效应因子（如DNMT3A、DNMT3L和KRAB）结合使用，可以增强对内源基因的击中即跑式可遗传沉默（5, 23, 24）。受到染色质调节因子之间内在相互作用的启发，多个团队进行了高通量筛选以进行研究
可编程基因激活的进展
虽然近年来用于可编程转录抑制的技术发展迅速，但由于哺乳动物转录激活的复杂性，用于基因激活的方法较为有限。此外，激活因子通常更依赖于基因本身，每个目标基因具有不同的最大转录输出。
传统上使用的合成dCas9基转录激活因子通常来源于病毒转激活结构域，如广泛使用的
表观基因组调节剂的治疗应用
近年来，可编程表观基因组编辑显示出了显著的治疗潜力。一个值得注意的进展是CHARM系统的开发，该系统由ZFP与组蛋白il和DNMT3L融合而成（37）。CHARM结构紧凑，可以通过AAV递送，用于沉默与朊病毒疾病相关的Prnp基因。将CHARM注射到小鼠大脑后，朊病毒蛋白水平降低了80%，并且沉默效果至少持续了13周。表观基因组编辑也被
关键挑战
尽管表观基因组和转录调节剂取得了快速进展，但在基础研究和转化应用中仍存在几个关键挑战和考虑因素。在本综述中，我们讨论了当前的障碍并概述了将进一步推动这一领域发展的未来方向。
结论和未来方向
基因组学和基因组工程的融合进展产生了强大的工具，以前所未有的速度修改人类基因的表观基因组和控制转录。仅在过去2-5年里，高通量平台的发展就发现了新的用于可编程转录抑制和激活的效应因子，从而大大推进了表观遗传学和转录的重编程工具箱。这一领域的快速发展体现在DNA
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：
James Karlo Nunez拥有一项专利，其专利使用费支付给加州大学。J.K.N.是与CRISPR技术相关的专利和专利申请的发明人，这些专利和专利申请由加州大学董事会和Chan Zuckerberg Biohub提交。如果有其他作者，他们声明没有已知的利益冲突或个人关系
资助
我们感谢以下机构的科研资助：美国国立卫生研究院（5R35GM155044）、Shurl和Kay Curci基金会、Pew慈善信托基金、Bakar实验室、Alfred P. Sloan基金会、Vallee基金会以及基因组学研究实验室。J.K.N.是旧金山Biohub的研究员。R.K.P.获得了Shurl和Kay Curci基金会和加州大学癌症研究协调委员会的研究生奖学金支持。N.S.D.获得了
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：James Karlo Nu?ez拥有一项专利，其专利使用费支付给加州大学。J.K.N.是与CRISPR技术相关的专利和专利申请的发明人，这些专利和专利申请由加州大学董事会和Biohub提交。其他作者没有已知的利益冲突或可能影响
