《Food and Bioproducts Processing》：Why do humic substances affect the properties of alkaline phosphatase?
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alkaline phosphatase与humic acids的液液界面竞争行为及酶活性调控机制研究，发现疏水性HA组分通过分子结合影响ALP结构，显著增强其催化活性，但未改变界面吸附特性。
玛丽亚·G·切尔尼谢娃 | 格奥尔基·S·米哈伊洛夫 | 玛丽亚·A·帕夫洛娃 | 格纳季·A·巴顿
罗蒙诺索夫莫斯科国立大学化学系，俄罗斯莫斯科 119991
摘要 碱性磷酸酶（ALP）是一种已被广泛研究的酶，能够在碱性pH环境中催化磷酸酯的水解反应。本研究分析了碱性磷酸酶（ALP）与腐殖酸（HA）之间的相互作用，特别是它们在水-苯体系中的竞争行为（在液-液界面上的分布和吸附），以及腐殖酸对ALP酶活性的影响。据我们所知，添加ALP可以降低腐殖酸的分布系数，表明其疏水片段发生了结合，但不会影响在液-液界面上的吸附。腐殖酸未能改变ALP的分布系数，但在浓度低于15毫克/升时略微增加了其吸附量，而在较高浓度下则降低了吸附量。然而，添加腐殖酸可使ALP的酶活性提高四倍。腐殖酸疏水性的降低以及酶活性的增强，可以通过分子对接模拟来解释，该模拟显示了ALP与腐殖酸中存在的疏水分子结合的过程。分子对接模拟揭示了疏水分子融入ALP结构的现象，这似乎增加了酶活性中心的可及性。
引言 碱性磷酸酶（ALP）是一种已被广泛研究的酶，能够在碱性pH环境中催化磷酸酯的水解反应（Holtz和Kantrowitz，1999年；Coleman，1992年；Millán，2006年）。催化过程中起关键作用的是Zn2?离子，它们是活性位点的一部分。水解过程分为以下步骤：含有磷酸基团的底物（R-OPO?2?）与活性位点结合，Zn2?使磷酸基团极化；通过Ser102与磷原子之间的相互作用形成共价磷丝氨酸中间体，并释放出醇；接下来是酶的脱磷酸化：由Zn2?离子激活的水分子攻击磷丝氨酸残基，释放出磷酸根阴离子（HPO?2?）。需要注意的是，活性位点的结构由Mg2?离子维持，该离子也加速了脱磷酸化过程。根据所描述的机制，除了pH值、离子强度和温度等常规因素会影响酶活性外，作为螯合剂的生物材料也可能降低ALP的活性。 腐殖物质（HS）是一类复杂的、异质性的有机化合物，形成于土壤、沉积物和水生环境中天然物质的分解过程中（Buurman，2003年；Klein等人，2018年；Rupiasih和Vidyasagar，2007年；Muscolo等人，2013年；Sutton和Sposito，2005年；Steinberg等人，2008年；Pédrot等人，2010年）。它们的生物学作用可以简要描述为：腐殖酸能促进细胞分裂、增强根系形成并加速种子发芽；通过促进颗粒聚集、改善空气流通和保持水分来改善土壤结构；最后，腐殖酸在污染物解毒中起重要作用，因为它们能结合农药、重金属和放射性核素，从而降低其毒性。此外，类似腐殖酸的物质可以与具有抗氧化活性的生物聚合物形成纳米颗粒（Savy等人，2025年）。腐殖酸的结构特征，包括其金属螯合中心，使其可能成为酶的抑制剂（Li等人，2013年；Li等人，2012年；Tan等人，2014年）。然而，也有许多研究表明腐殖酸可以包裹酶并抑制其活性（Tomaszewski等人，2011年；Roomi等人，2018年；Tomaszewski等人，2012年；Sander等人，2012年）。尽管没有证据表明从细菌或哺乳动物中分离出的ALP与环境中的腐殖酸有直接相互作用，但它们之间的生态相互作用通过竞争金属辅因子、修饰酶的底物以及酶在腐殖基质上的物理吸附来实现。另一方面，腐殖酸与土壤磷酸酶（特别是由植物根系和微生物产生的酸性和碱性磷酸单酯酶）之间的相互作用在陆地和水生生态系统中都很普遍（Dring等人，1971年；Janicka等人，2024年）。
从基础科学的角度来看，研究酶与腐殖物质之间的相互作用可以视为与一种具有双重性质的高分子量配体的相互作用。实际上，腐殖酸的结构模型包含一个疏水核心和一个亲水外围部分，赋予其表面活性。需要注意的是，腐殖酸的组成成分通过氢键和疏水-范德华相互作用结合在一起。因此，在非破坏性条件下，腐殖酸的行为类似于聚合物（Kudryavtsev等人，2000年；Perminova等人，1998年）；而在某些条件下，腐殖酸可以被视为超分子（Nebbioso和Piccolo，2013年；Nebbioso和Piccolo，2011年）。
本研究的主要目的是确定并解释腐殖酸（HA）与ALP之间的结合机制。从
E. coli 中分离出的ALP的等电点为pH 4.5（
https://www.worthington-biochem.com/products/phosphatase-alkaline/manual ），而其他来源的酶的等电点在5到6之间，而酶活性的最佳pH值为8到10（Garcia等人，2011年）。因此，该酶在负电荷蛋白质存在下表现出最大活性。在考虑与HA的相互作用时，可以预期分子之间存在排斥作用，但一些研究表明腐殖物质对ALP活性有显著影响（Al-Malaky等人，2024年；Mazzei等人，2013年；Kandeler，1990年；Boavida和Wetzel，1998年）。在本研究中，我们研究了两种不相溶液体界面处HA与ALP之间的相互作用。这是一个高度简化的模型，但有助于研究疏水效应和被动传输（Huang和Wang，2025年；Qtaishat等人，2022年）。化合物在液-液界面的行为模拟了它们与细胞膜之间的相互作用。虽然由于有多种研究方法，包括表面活性剂和油在内的各种化合物在固体表面的吸附过程已被很好地描述（Din等人，2025年；Meconi等人，2016年；Khan等人，2020年；Kenawy等人，2018年；Ali等人，2019年；Degen等人，2019年；Alothman，2012年），但液-液界面仍然难以直接研究。为了确定液-液界面上HA和ALP的直接量，我们使用了氚标记的HA和ALP，并采用液体闪烁光谱法作为闪烁相方法（Chernysheva等人，2020年）。该方法基于氚同位素的独特性质，即β粒子的能量低，这使得在浓缩介质中的传播路径较短。因此，水-苯基闪烁体测得的放射性是由标记化合物在闪烁体体积中的放射性及其在液-液界面的吸附共同造成的。因此，我们可以确定与标记化合物的疏水性相关的分布系数及其在液-液界面的吸附量。然而，我们的方法允许我们直接测量不相溶液体界面上的物质量。放射化学方法结合使用悬滴技术的张力测量，可以更全面地描述系统，甚至适用于含有低表面活性化合物的混合物（Chernysheva等人，2021a）。我们还在HA存在下测量了ALP的酶活性。然而，与之前的研究（Mazzei等人，2013年）不同，我们在低浓度的腐殖物质下进行了研究，因为在这种情况下观察到了它们的活性（Kulikova等人，2010年）。为了解释实验结果，我们对腐殖物质组成中的一些分子进行了分子对接分析。
材料 E. coli 碱性磷酸酶由SibEnzyme（俄罗斯，产品编号C-E366；制造商标注的浓度为5000单位/毫升）提供。实验使用由SibEnzyme（俄罗斯）提供的浓缩储备液制备的Tris缓冲液进行。最终缓冲液的组成包括10毫摩尔的Tris-HCl（pH 8.5，25°C）；10毫摩尔的MgCl?；100毫摩尔的NaCl；1毫摩尔的DTT。0.028毫摩尔的磷酸缓冲液（Chernysheva等人，2020年）也被用作表征胶体性质的标准。
结果与讨论 由于我们之前关于腐殖物质胶体性质的研究是在0.028毫摩尔磷酸缓冲液下进行的，我们将0.028毫摩尔磷酸缓冲液中的分布比值与Tris缓冲液中的分布比值进行了比较。图1显示了苯相中腐殖酸浓度与其在水相中浓度的关系。分布比值是根据公式3确定的。
在0.028毫摩尔磷酸缓冲液的情况下，分布比值为
结论 总之，通过放射化学方法，我们证明了腐殖酸和碱性磷酸酶在水-苯体系中分布以及液-液界面吸附时存在竞争性相互作用。观察到的腐殖酸分布系数的轻微降低可以归因于腐殖酸的疏水成分穿透蛋白质结构，并与不直接参与酶活性位点的氨基酸残基发生相互作用。
CRediT作者贡献声明 格奥尔基·S·米哈伊洛夫： 研究。玛丽亚·A·帕夫洛娃： 研究。格纳季·A·巴顿： 写作——审稿与编辑、监督、研究、数据管理。玛丽亚·G·切尔尼谢娃： 写作——审稿与编辑、研究、数据管理、概念化。
利益冲突声明 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢 本研究由俄罗斯联邦科学与高等教育部下属的罗蒙诺索夫莫斯科国立大学资助，项目编号为122012600116-4，项目名称为“获取和应用放射性核素及标记化合物用于核医学、研究生物重要过程以及生物体与电离辐射的相互作用”。
