动态辅酶调控驱动了工程改造大肠杆菌中高效的D-塔格糖生物合成

《Food Bioscience》：Dynamic coenzyme regulation drives high-efficiency D-tagatose biosynthesis in engineered Escherichia coli

D-塔格托糖微生物合成效率通过工程化大肠杆菌提升，采用共表达GDH和XR的代谢途径，辅因子工程调控NADPH/NAD+动态平衡，使产率达34.92 g/L，效率提升7.23倍。

　　

李玉梅|涂一凡|任赞宇|谢殿东|王慕兰|李宁|梁晨|刘继东

广西大学轻工与食品工程学院，中国广西南宁市大学路100号，530004

摘要

D-塔格糖（D-Tagatose）是一种具有明确健康益处的功能性稀有糖，其在制药和食品行业具有巨大应用潜力。尽管基于氧化还原的生物合成方法可以克服D-塔格糖生产中的热力学平衡限制，但其反应效率仍然是一个关键瓶颈。在此，我们开发了一种经过工程改造的大肠杆菌（Escherichia coli）催化剂，以实现D-塔格糖的高效微生物生产。首先通过共表达半乳糖醇-2-脱氢酶（galactitol-2-dehydrogenase，GDH）和木糖还原酶（xylose reductase，XR）来构建生物合成途径，从而将源自半乳糖的碳流导向D-塔格糖的合成。随后通过辅因子工程调整NADPH与NAD⁺之间的平衡，将初始的NAD⁺/NADH和NADP⁺/NADPH比例从0.67和3.42分别调整为0.77和0.88，从而改善了氧化还原平衡和整个途径的性能。系统性的代谢调控使D-塔格糖的产量提高了7.23倍，在优化的全细胞催化条件下，最终产量达到34.92克/升（产率：0.87克/克D-半乳糖，时空产率：0.55克/升·小时）。我们的研究表明，针对NADPH–NAD⁺平衡的调控为增强氧化还原依赖性的生物转化提供了一种通用策略。这种方法为稀有糖的生物合成提供了可持续的替代方案。

引言

过量摄入传统糖类与多种代谢紊乱密切相关，包括肥胖、糖尿病和心血管疾病，对人类健康构成严重威胁（Huang等人，2023年）。因此，食品和制药行业正在积极寻找既能保持感官接受度，又能降低热量摄入、几乎不会引起血糖反应并具有额外生理益处的甜味剂。由于其独特的代谢特性和生理功能（如抗氧化、抗龋齿、餐后血糖调节和冷冻保护作用），稀有糖已成为有前景的候选物质（Wen等人，2025年）。其中，D-塔格糖被普遍认为是一种安全的甜味剂，其甜度相当于蔗糖的90%，但热量仅为其三分之一，并且人体对其的吸收率仅为20%（Fan等人，2025年；Guerrero-Wyss等人，2018年）。这些特性使D-塔格糖成为下一代低热量甜味剂，适用于功能性食品、膳食补充剂和药品辅料等领域。

关于D-塔格糖生物合成的最新研究主要集中在两个方向：扩大底物范围以降低原材料成本，以及解决现有合成途径的热力学限制。传统方法主要依赖D-半乳糖或乳糖作为原料。然而，最近的创新方法已成功将底物范围扩展到更经济的替代品，如淀粉、麦芽糊精和果糖（Dai等人，2022年；Han等人，2023年；Shin等人，2020年）。在代谢工程领域，研究重点在于解决基于异构酶的传统系统的固有缺陷。这些系统通常使用L-阿拉伯糖异构酶或塔格糖-4-差向异构酶，但在中温范围内无法将底物与产物的质量浓度比超过7:3（Jeon等人，2023年；Xu等人，2024年）。为克服这一热力学限制，研究人员在酵母系统中使用了木糖还原酶（XR）和半乳糖醇-2-脱氢酶（GDH），将D-半乳糖与D-塔格糖的质量浓度比提高到了1:9（J.-J. Liu等人，2019年）。然而，XR和GDH分别依赖于辅酶NADPH和NAD⁺，它们对辅酶的不同需求导致了细胞内的氧化还原失衡，从而限制了反应效率。具体来说，存在两个关键问题：（i）辅酶再生效率不足引发氧化还原失衡；（ii）细胞内内源性辅酶浓度无法维持连续催化。

为了解决这些问题，研究人员专注于通过调节辅酶来提高D-塔格糖的合成效率。传统的辅因子调控策略通常侧重于强化单一辅酶。例如，在D-塔格糖的合成中，过表达吡啶核苷酸转氢酶（PntAB）可促进NAD(P)H的再生，使D-塔格糖的产量提高了12.89%（G. Zhang等人，2023年）。类似的传统方法也被应用于其他功能性稀有糖的合成。例如，通过扩大细胞内的NAD(H)池，研究人员在12小时内实现了10.72克/升的艾托醇（allitol）产量，转化率为68.4%（Zhao等人，2022年）。然而，这些单一策略无法有效解决多酶催化过程中不同辅酶需求导致的系统性失衡。为了克服这一限制，研究人员通过理性蛋白质工程改造了原本依赖NAD⁺的半乳糖醇脱氢酶，使其能够利用NADP⁺。利用这种突变体构建的NADPH循环系统在96小时内合成了6.30毫摩尔的D-塔格糖，乳糖转化率为0.31摩尔/摩尔（Ma等人，2024年）。尽管这种方法部分缓解了辅酶依赖性的差异，但D-塔格糖的合成效率仍不尽如人意。这表明由不同辅酶依赖性引起的系统性催化失衡尚未得到根本解决。

为了解决D-塔格糖合成过程中由于辅酶依赖性不同而导致的催化失衡问题，本研究提出了一种双重辅酶协调调控策略。与现有的单一辅酶调控方法不同，该策略同时协调NADPH供应和NAD⁺再生途径（图1），在大肠杆菌（E. coli）中建立了一个具有精细调节辅酶能力的D-塔格糖合成系统。所构建的细胞工厂能够在催化过程中动态维持NADPH和NAD⁺之间的平衡，从而实现系统的氧化还原辅酶平衡。这项工作为高效且经济地生产D-塔格糖提供了一种新方法。我们还提出了一种潜在的解决方案，以解决传统多酶级联反应中辅酶竞争带来的效率限制，从而促进其工业化应用。

部分内容摘要

菌株和试剂

相关质粒和菌株均列于表1中。使用大肠杆菌DH5α作为基因克隆的宿主，而大肠杆菌BL21(DE3)作为D-塔格糖生物合成的工程生产宿主。

酵母提取物、蛋白胨、NaCl、琼脂粉、琼脂糖、异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）、D-半乳糖、D-葡萄糖、果糖、半乳糖醇、D-塔格糖标准品、抗生素、无缝克隆试剂盒、KH₂PO₄、K₂HPO₄·3H₂O、胰蛋白胨、烟酸和PBS缓冲液均从相关供应商处购买。

途径设计和关键酶选择

基于氧化还原的途径已成为稀有糖合成的一般方法（Nakakita & Hirabayashi，2025年），为传统的异构化方法提供了一种灵活且高效的替代方案。筛选和比较评估具有优良催化特性的GDH变体对于提高D-塔格糖的合成效率至关重要。根据文献中报道的酶学特性，选择了三种代表性的半乳糖醇脱氢酶。

结论

在本研究中，我们通过构建和优化大肠杆菌BL21(DE3)中的氧化还原途径，开发了一种高效的D-塔格糖生产细胞工厂。通过引入双重辅酶调控策略，实现了大肠杆菌细胞内NADPH和NAD⁺的协同供应和动态平衡。这一策略显著提升了SgXR和AfGDH酶的催化性能。在以40克/升D-半乳糖为底物的全细胞催化反应中，我们获得了

CRediT作者贡献声明

涂一凡：验证、实验研究。李玉梅：撰写初稿、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构建。谢殿东：验证、实验研究。任赞宇：验证、实验研究。刘继东：撰写、审稿与编辑、项目监督、资金筹集。王慕兰：验证、实验研究。梁晨：验证、实验研究。李宁：验证、实验研究

伦理批准

不适用

利益冲突

作者声明没有与本文内容相关的利益冲突。本研究不涉及人类参与者或动物实验。所有作者均已阅读并批准了最终稿件。

数据和材料的可用性

本研究生成或分析的所有数据均包含在发表的文章中

资助

本研究得到了中国国家重点研发计划（2024YFD2200804-4）、广西自然科学基金（2025GXNSFAA069706）和广西研究生教育创新项目（YCSW2025127）的资助。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。