一种基于CuFe?O?磁性颗粒类氧化酶活性的外部无矩阵荧光传感平台，用于检测酪蛋白磷酸肽

《Food Chemistry》：An external blank matrix-free fluorescence sensing platform based on the oxidase-like activity of CuFe 2O 4 magnetic particles for detecting casein phosphopeptide

Casein Phosphopeptide (CPP)的快速检测方法研究提出基于CuFe2O4和TiO2@PDA@Fe3O4磁性颗粒的荧光传感平台，通过消除基质干扰实现高灵敏度检测（LOD 1.04 μg/mL），并开发便携设备用于现场分析。

　　

刘凯欣|张宏轩|关志宏|苏慧慧|吕芳洲|傅莉|贾莉

中国华南师范大学光电科学与工程学院生物光子学系，激光生命科学教育部重点实验室、广东省激光生命科学重点实验室及光谱分析与功能探针广州重点实验室，广州510631。

摘要

酪蛋白磷酸肽（CPP）是一种有助于增强钙吸收和促进骨骼矿化的肽类物质，是婴儿配方奶粉中的关键营养强化成分。然而，快速准确地检测CPP仍然具有挑战性。本研究提出了首个无需外部空白基质、可在现场使用的CPP荧光传感平台。该方法结合了CuFe₂O₄磁性颗粒（MPs）和TiO₂@PDA@Fe₃O₄磁性颗粒的功能。CuFe₂O₄磁性颗粒具有类似氧化酶的活性，能够催化o-苯二胺（OPD）的氧化并产生荧光，而CPP可以抑制这一过程。同时，TiO₂@PDA@Fe₃O₄磁性颗粒在预处理过程中能够选择性吸附CPP和磷酸盐杂质，从而减少基质干扰。该平台通过未知奶粉样品进行了验证，表现出优异的选择性、灵敏度和准确性（检测限：1.04?μg?mL^?1，线性范围：5–100?μg?mL^?1，回收率：96.2–108.5%，相对标准偏差：< 4.6%）。此外，还设计了一种便携式设备，实现了CPP的现场检测。

引言

钙补充对于治疗某些疾病（如佝偻病、慢性肾病、骨质疏松症等）非常重要（Peacock, 2010）。维生素D通过激活肠道钙转运蛋白来增强十二指肠和近端空肠的钙吸收（Christakos et al., 2016）。然而，其亲脂性可能导致吸收效率低下，而且维生素D过量摄入可能引起累积毒性和高钙血症（Marcinowska-Suchowierska et al., 2018）。酪蛋白磷酸肽（CPP）作为一种新型钙螯合肽，在钙补充方面具有明显优势。通过与钙离子形成可溶性复合物，CPP可以防止钙在碱性肠道环境（如回肠）中沉淀，从而扩大钙的吸收范围（Liu et al., 2024）。此外，CPP在敏感人群（包括婴儿和肾功能障碍者）中表现出更高的安全性。因此，CPP被广泛用于营养保健品中。然而，CPP过量摄入可能会增加胃肠道和肾脏的负担（Singh et al., 2022）。根据中国国家标准（GB 14880–2012, 2012），婴儿配方奶粉中CPP的最大添加量为3.0?g/kg。因此，开发准确的CPP定量方法对于合理设计营养保健品配方至关重要。其中，在婴儿配方奶粉中检测CPP是最具挑战性的任务之一，因为复杂的样品基质中含有脂肪、蛋白质和含有磷酸基团的杂质等干扰因素。

传统的检测方法包括钡-乙醇沉淀法（GB 31617–2014, 2014）、毛细管区电泳（CZE）（Mou et al., 2013）、高效液相色谱（HPLC）（Ge et al., 2021）和高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）（Olumee-Shabon & Boehmer, 2013）。钡-乙醇法操作简单且成本低廉，但缺乏特异性和准确性，不适用于复杂基质。尽管色谱和电泳技术具有更高的灵敏度，但它们对仪器的要求较高，限制了实际应用。因此，乳制品企业迫切需要快速且经济高效的检测技术来监测CPP含量。

光学生物传感平台具有变革潜力，基于荧光的方法因其出色的灵敏度、快速响应和低成本而受到关注（Li et al., 2021; Yao et al., 2021）。许多研究证明了荧光传感器在高度选择性和灵敏度检测多种目标物（包括有机磷农药和生物标志物）方面的应用（Chang et al., 2016; Li et al., 2020; Li et al., 2023）。最近，我们报道了首个用于乳制品中CPP的荧光测定方法（Guan et al., 2025）。该方法利用具有类似过氧化物酶活性的铜离子（Cu²⁺），但CPP会抑制这种活性。然而，在实际样品检测中需要使用制造商提供的空白奶粉样品作为参考，这限制了其应用。

本研究提出了一种无需外部空白基质的荧光传感平台用于检测CPP（图1B）。该方法基于CuFe₂O₄磁性颗粒和TiO₂@PDA@Fe₃O₄磁性颗粒的协同作用。CuFe₂O₄磁性颗粒具有类似氧化酶的活性，可以催化o-苯二胺（OPD）氧化生成荧光物质2,3-二氨基吩嗪（Deng et al., 2022; Guan et al., 2025; Ye et al., 2020）。同时，CPP含有独特的磷酸化丝氨酸-谷氨酸序列（-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Glu）（Cruz-Huerta et al., 2015），该序列可以与Cu(II)配位（Huang et al., 2022）。因此，CPP理论上可以抑制Cu(II)的类似氧化酶活性，降低OPD的氧化程度，从而降低荧光强度。通过检测荧光强度的变化，可以定量检测CPP。为了提高检测灵敏度并解决对空白参考样品的依赖问题，引入了基于TiO₂@PDA@Fe₃O₄磁性颗粒的样品预处理方法。研究表明，TiO₂对磷脂具有选择性吸附作用，这是因为Ti(IV)位点对磷酸基团具有高亲和力，可以通过路易斯酸碱相互作用实现双齿配位（Liu et al., 2015; Liu et al., 2019; Lu et al., 2010）。因此，我们将TiO₂修饰到功能化磁性颗粒上，制备出TiO₂@PDA@Fe₃O₄磁性颗粒，作为吸附剂选择性地去除CPP，实现无需外部空白基质的检测，并有效去除磷酸盐杂质。通过检测奶粉样品中的CPP，验证了该传感平台的可行性。该方法在第三方公司提供的未知样品中的准确性得到了证实，证明了其在实际应用中的潜在价值。此外，为了将创新成果应用于实际检测，还开发了一种3D打印的便携式设备，实现CPP的现场分析。

试剂和设备

试剂和设备（文本S1）详见支持信息（SI）。

材料表征

材料表征的详细描述（文本S2）见支持信息（SI）。

CuFe₂O₄磁性颗粒的合成

CuFe₂O₄磁性颗粒采用水热法制备（Zhang et al., 2014），并进行了一些调整（图1A）。首先将EG（60?mL）与DEG（20?mL）混合，然后加入FeCl₃（1.95?g）得到澄清的黄色溶液，再加入CuCl₂·2H₂O（1.02?g）得到透明的橙黄色混合物。

CuFe₂O₄磁性颗粒和TiO₂@PDA@Fe₃O₄磁性颗粒的表征

使用TEM图像观察CuFe₂O₄磁性颗粒的形态和尺寸。如图2A所示，合成的CuFe₂O₄磁性颗粒分布均匀，呈球形且形状规整，平均直径约为123.9?±?15.8?nm。图2B显示了CuFe₂O₄磁性颗粒在水中的流体力学直径分布直方图。这些磁性颗粒具有动态光散射特性，平均直径为446.5?±?4.7?nm。

结论

目前，CPP的检测方法存在精度不足或依赖大型昂贵仪器的问题。本研究开发了一种无需外部空白基质的荧光传感平台，利用CuFe₂O₄磁性颗粒的类似氧化酶活性来检测CPP。通过使用TiO₂@PDA@Fe₃O₄磁性颗粒，显著提高了CPP的检测灵敏度，检测限为1.04?μg?mL^{?1（符合中国国家标准GB 14880–2012）。}

CRediT作者贡献声明

刘凯欣：撰写初稿、方法设计、实验研究、数据分析、概念构建。张宏轩：软件开发。关志宏：结果验证。苏慧慧：结果验证。吕芳洲：结果验证。傅莉：撰写、编辑、结果验证、实验监督。贾莉：撰写、编辑、实验监督、资金获取、概念构建。

未引用参考文献

Jarusheh, Al Jitan, Banat, Haija 和 Palmisano, 2023

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号21675056）的支持。