《Food Chemistry: X》：Main characteristic metabolites with xanthine oxidase inhibitory activities from Yunnan
Coffea arabica husks
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本研究针对咖啡加工副产物果皮资源化利用不足的问题，系统开展了云南小粒咖啡果皮中特征代谢物的鉴定及其黄嘌呤氧化酶抑制活性研究。通过LC-MSn-IT-TOF分析结合体外活性评价，鉴定出55种主要化合物，揭示了绿原酸类似物是核心活性成分，其通过自发结合XO发挥抑制作用，并结合分子对接阐明了构效关系，为从天然副产物中开发XO抑制剂提供了新视角。
咖啡作为全球最重要的贸易商品之一，其加工过程中会产生大量副产物，其中咖啡“果皮”（包括果肉、黏液、干皮和内果皮）约占咖啡樱桃重量的45%-50%，年产量巨大。这些果皮通常被直接丢弃到环境中，不恰当的处理可能导致土壤破坏和环境污染。然而，咖啡果皮实际上富含多种生物活性成分，如绿原酸、p-香豆酸和阿魏酸等酚类物质，这些成分与抗氧化活性密切相关，并已被广泛证实具有强大的自由基清除能力。研究表明，这些酚类化合物具有抗炎、抗菌、抗癌、心血管保护和抑制黄嘌呤氧化酶等多种生物活性。因此，深入探索和实际应用这些副产物具有重要的经济和环保价值。
在此背景下，研究人员针对云南小粒咖啡果皮这一广泛废弃的天然副产物，开展了一项综合研究，旨在系统鉴定其主要特征代谢物，并评估其抗氧化和XO抑制活性，为开发天然低毒的XO抑制剂提供理论依据。该研究成果发表在《Food Chemistry: X》上。
为开展此项研究，作者团队主要运用了几项关键技术：首先，采用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱联用技术对咖啡果皮提取物进行非靶向代谢组学分析，精确鉴定化合物结构；其次，通过体外化学分析法系统评价了样品的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力和铁离子还原抗氧化能力；同时，利用体外酶抑制模型评估了样品对黄嘌呤氧化酶的抑制活性；最后，借助分子对接模拟技术，深入探究了关键活性成分与XO蛋白的相互作用机制和构效关系。研究样本来源于云南省不同纬度产区（普洱、保山、大理）并经过不同初加工处理（日晒、水洗、蜜处理）的小粒咖啡果皮。
3.1. 咖啡果皮的体外抗氧化和XO抑制活性
研究人员首先对11份不同初加工处理的咖啡果皮样品进行了体外抗氧化和XO抑制活性测定。结果表明，在4.0 mg/mL浓度下，仅有K2和K4样品表现出XO抑制活性。在抗氧化活性方面，K2、K4、K6和K8四个样品表现出优异的ABTS自由基阳离子和DPPH自由基清除能力以及FRAP抗氧化活性。其中，水洗处理的K2样品在所有测定中均显示出最强的活性。因此，研究人员筛选出这四份活性最佳的样品进行后续深入的化学成分分析。
3.2. 基于LC-MSn-IT-TOF的咖啡果皮主要化合物组成
通过LC-MSn-IT-TOF分析，共鉴定出55种化合物，包括4种氨基酸、3种有机酸、7种苯甲酸及其衍生物、9种肉桂酸及其衍生物、5种其他酚类、11种类黄酮及其衍生物、8种萜类、3种甾体、2种脂肪酸和3种其他化合物。在负离子模式下，获得了四个代表性样品的基峰色谱图及其化合物归属。研究人员详细解析了各类化合物的质谱裂解规律，特别是苯甲酸衍生物、肉桂酸衍生物、类黄酮衍生物、萜类和甾体化合物的特征碎片离子，为准确鉴定提供了依据。
3.3. 水洗和日晒咖啡果皮的关键特征化合物
通过对四种咖啡果皮样品中化合物色谱峰面积的归一化分析，发现肉桂酸及其衍生物是四份样品中含量最丰富的类别，其中主要为绿原酸类似物。在不同初加工方式方面，日晒处理的果皮含有更多的氨基酸和有机酸，而水洗处理的果皮则含有显著更多的苯甲酸及其衍生物、萜类、甾体和脂肪酸。通过韦恩图分析，确定了14种共有成分，主要为肉桂酸及其衍生物。同时，筛选出香草酸、王不留行黄酮苷和槲皮素-3-槐糖苷作为日晒咖啡果皮的特征代谢物，而8-姜酚和松属素则被选为水洗咖啡果皮的特征化合物。
3.4. 活性与化合物之间的相关性
相关性分析显示，三种抗氧化活性与XO抑制活性之间存在高度一致性。共有15种化合物与抗氧化活性和XO抑制活性呈正相关，其中绿原酸类似物是贡献咖啡果皮生物活性的主要成分。此外，七种化合物与抗氧化活性和XO抑制活性均呈现显著相关性，包括白花丹素、松属素等，这些化合物被认为是水洗果皮K2样品卓越抗氧化和XO抑制能力的关键贡献者。
3.5. 绿原酸类似物的体外抗氧化和XO抑制活性
体外活性测试表明，六种绿原酸类似物均表现出良好的抗氧化活性。双取代绿原酸的三种抗氧化活性显著高于单取代绿原酸。在体外XO抑制活性测定中，4-O-咖啡酰奎宁酸在0.5 mmol/L浓度下表现出最高的XO抑制率。同时，具有C-4取代的双咖啡酰奎宁酸表现出更优的XO抑制活性，表明咖啡酸取代的位置影响了绿原酸的XO抑制活性。
3.6. XO抑制活性的分子对接研究
分子对接模拟研究了XO与配体之间的相互作用。结果显示，六种绿原酸分子均能自发与XO结合，尽管其结合自由能显著高于阳性对照。在单取代绿原酸中，5-O-咖啡酰奎宁酸显示出最大的XO抑制潜力。在双取代绿原酸中，3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸表现出最强的XO抑制活性。此外，类黄酮化合物如白花丹素、非瑟酮和松属素与XO的结合能和Ki值低于阳性对照，表明白花丹素保留的色酮核心可能是抑制活性的关键结构特征。类黄酮不同环上的取代基也影响了物质的活性。
本研究系统阐明了云南小粒咖啡果皮这一废弃副产物中的主要特征代谢物组成、体外生物活性及其作用机制。研究证实，绿原酸类似物是咖啡果皮中关键的生物活性成分，具有显著的抗氧化和潜在的XO抑制活性。其抑制作用源于它们能够自发与XO结合，双取代绿原酸因其更强的疏水相互作用和氢键形成能力而表现出更优的活性。此外，研究还发现类黄酮和萜类化合物，特别是那些含有稳定色酮基团的类黄酮，对水洗咖啡果皮的突出生物活性有重要贡献。该研究不仅为咖啡果皮的高值化利用提供了科学依据，也为从天然副产物中开发新型抗氧化剂和XO抑制剂开辟了新途径，对促进咖啡产业的可持续发展和实现废弃物资源化具有重要的理论和实践意义。
