《Food Hydrocolloids》：Machine-learning-guided extraction optimization and physicochemical characteristic of GRAS microalgae proteins for sustainable food applications
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本研究针对微藻蛋白提取中存在的细胞壁抗性及提取过程导致的品质损失问题，开展了超声波辅助碱法提取GRAS（公认安全）微藻蛋白的优化研究。通过响应面法（RSM）和高斯过程回归（GPR）建模，优化了A. platensis、C. pyrenoidosa和C. sorokiniana的提取工艺，显著提升了蛋白回收率（PR）和得率（PY），并系统评估了蛋白浓缩物的理化及功能特性。该研究为微藻蛋白的高效、可持续提取及在食品工业中的应用提供了理论依据和技术支撑。
随着全球人口预计到2050年将超过97亿，对膳食蛋白质的需求将急剧增加，这对食品系统的可持续性构成了严峻挑战。传统的动物源蛋白虽然提供全面的营养，但伴随着巨大的环境负担，包括温室气体排放、土地退化和生物多样性丧失。此外，当前的估计将粮食生产定位为气候变化的第三大贡献者，仅次于能源部门和人口增长，这凸显了对可扩展、低影响替代品的迫切需求。水生生物，特别是微藻，因其高蛋白含量（干重的40-70%）、快速生长速率以及对耕地和淡水的需求极低而受到特别关注。历史上，诸如Arthrospira platensis（螺旋藻）和Chlorella vulgaris等微藻早已在多个地区被用作食物来源。此外，包括Chlorella、Spirulina和Nostoc在内的几种微藻已获得美国FDA的“公认安全”（GRAS） status，确认了其人类食用的安全性和适用性。
然而，微藻蛋白的广泛应用受到两个主要因素的限制：一是其坚韧的细胞包膜（如纤维素和藻烯醇丰富的细胞壁）限制了蛋白质的释放；二是提取过程本身可能导致蛋白质变性或功能丧失，从而影响最终产品的质量和应用潜力。因此，开发高效、温和且能保持蛋白质功能特性的提取方法至关重要。超声波辅助提取作为一种物理加工技术，能通过空化效应有效破坏细胞结构，提高提取效率，但其效果受微藻物种、细胞壁结构及提取参数（如振幅、占空比、时间）的显著影响，需要进行系统优化。
在此背景下，本研究旨在评估超声波辅助碱法提取作为一种面向食品配料应用的工艺，针对三种GRAS微藻：Chlorella pyrenoidosa、Arthrospira platensis和Chlorella sorokiniana。研究首先比较了超声浴和超声探头两种模式的效率，然后采用响应面法（RSM）结合机器学习中的高斯过程回归（GPR）对提取过程进行优化，以量化预测不确定性并支持稳健操作区域的选择。最后，对获得的微藻蛋白浓缩物进行了SDS-PAGE、FTIR分析以及溶解性、乳化性、起泡性等功能特性表征，从而将提取条件与对食品配方至关重要的成分性能指标联系起来。该研究为微藻蛋白的可持续生产提供了能量透明、多响应优化的框架，相关成果发表在《Food Hydrocolloids》期刊上。
为开展此项研究，作者团队运用了几个关键的技术方法。研究选用了六种具有GRAS status的微藻物种，主要聚焦于C. pyrenoidosa、A. platensis和C. sorokiniana。蛋白质提取采用超声波辅助碱法，核心是比较超声浴和超声探头两种配置在不同参数（振幅、占空比、时间）下的效率，并通过量热法对能量输入进行量化。实验设计采用Box-Behnken设计（BBD）进行响应面优化，并引入高斯过程回归（GPR）进行不确定性建模和交叉验证。对提取的蛋白质浓缩物，通过Bradford法和杜马斯定氮法测定蛋白回收率（PR）和蛋白得率（PY），并利用SDS-PAGE和FTIR进行蛋白表征。功能性质评估则涵盖了在不同pH条件下的蛋白质溶解性、起泡性、泡沫稳定性、乳化活性指数（EAI）、乳液稳定性指数（ESI）、吸水能力（WAC）和吸油能力（OAC）。
3. 结果与讨论
3.1. 最佳细胞破碎技术的选择
初步的单变量优化（OVAT）研究表明，对于模型微藻C. vulgaris（以其坚硬、富含纤维素和藻烯醇的细胞壁为特征），超声辅助提取 consistently 比未处理的对照产生更高的蛋白质回收率。在六种GRAS微藻中，A. platensis表现出最优的提取性，这反映了其丝状蓝细菌形态，缺乏刚性纤维素层，而两种Chlorella物种则由于细胞壁结构复杂，回收率相对较低。超声模式的比较显示，探头超声在所有三种物种中均 consistently 优于（p< 0.05）超声浴和未处理的对照。探头超声能够将高度聚焦的声能直接传递到悬浮液中，产生局部空化、剪切力和微流，从而更有效地促进细胞壁破裂和蛋白质增溶。能量归一化比较表明，尽管探头超声的名义能量输入显著较低，但其蛋白质回收率更高，单位回收率能耗显著降低。显微镜观察证实了这些效果：未经处理的细胞保持完整的形态，超声浴处理的细胞仅显示轻度变形，而探头超声导致所有三种物种出现明显的碎片化、破裂和细胞质释放。因此，研究选择探头超声作为后续优化的基础破碎策略。
3.2. 响应面法优化蛋白质提取
采用Box-Behnken设计（BBD）实验框架，系统优化了三种GRAS微藻的超声波辅助碱法蛋白质提取。三个独立的超声波参数——振幅（%）、占空比（%）和超声时间（min）被选为影响因素。对于C. pyrenoidosa，响应主要由占空比（X2）、振幅（X1）和持续时间（X3）的线性效应主导，交互作用和二次项不显著，表明能量输入和暴露时间具有近加性贡献。对于A. platensis，模型项均未达到统计学显著性，表明在所探索的超声波空间内，响应 largely 处于饱和释放状态，增量超声波强度产生递减回报。相比之下，C. sorokiniana表现出高度响应的曲面，具有高度显著的线性项和显著的X2×X3交互作用，表明脉冲和暴露时间之间存在协同效应。回归模型对C. pyrenoidosa和C. sorokiniana显著，但对A. platensis不显著。响应曲面图直观地显示了物种解析的提取控制机制：C. pyrenoidosa的等高线大致呈平面状；A. platensis的等高线间距宽，梯度浅，表明饱和行为；C. sorokiniana则显示出更陡的梯度和脊状特征。
3.2.1. 高斯过程回归作为RSM的 uncertainty-aware 补充
高斯过程回归（GPR）被用作一种不确定性感知的替代模型，以补充二次RSM模型。GPR定义了一个在 plausible 响应函数上的分布，并返回一个后验预测分布，该分布自然地将预测的平均响应与模型不确定性分离开来。对于C. sorokiniana，GPR作为一个确认性的替代模型；对于C. pyrenoidosa，GPR改善了预测行为，其不确定性表面揭示了某些高响应区域与升高的不确定性相吻合；对于A. platensis，GPR的关键贡献是诊断性的，表明存在饱和响应机制。通过配对报告后验均值和不确定性曲面，将RSM式的最大值转化为可重复的操作窗口，并进行了合理的机制分类（可推广的 vs 非二次的 vs 饱和的）。
3.2.2. RSM和GPR模型的验证及蛋白质提取的优化
模型验证被构建为一个样本外泛化问题。留一法交叉验证（LOOCV）表明，对于C. sorokiniana，RSM和GPR模型均表现出稳健且一致的预测能力；对于C. pyrenoidosa，二次RSM表现出较差的泛化能力，而GPR改善了预测性能；对于A. platensis，两种范式下均保持负的预测R2，表明可控性有限。独立的验证实验针对C. pyrenoidosa和C. sorokiniana进行。在最佳PR点，两种模型均表现出高保真度。在压力测试条件下（节能条件和时间最小化条件），揭示了边界特定的失效模式和时间补偿效应。最终确定的优化提取设置为：C. pyrenoidosa（振幅97.9%，占空比97.7%，时间14.5 min），C. sorokiniana（振幅89.5%，占空比99.2%，时间13.9 min），A. platensis则采用设计中心点（振幅50%，占空比50%，时间10 min）作为最可靠的操作建议。
3.3. 分离蛋白的理化特性
3.3.1. 分离蛋白的总蛋白含量
across 物种，蛋白质富集的程度反映了细胞壁结构和含氮生物分子的特异性/溶解性。优化后，A. platensis的蛋白质浓缩物含量最高（干基77.56%），C. pyrenoidosa次之（72.24%），C. sorokiniana相对较低（64.23%）。这反映了物种间细胞壁可渗透性和共提取非蛋白组分（如多糖、色素）的差异。
3.3.2. 微藻蛋白浓缩物的SDS-PAGE分析
SDS-PAGE分析显示，三种微藻在优化前后均显示出保守的分子量分布，主要条带位于~15-20 kDa、~25-37 kDa和~50 kDa区域，可能分别对应藻胆蛋白、中等大小蛋白和RuBisCO大亚基。优化处理主要增强了条带强度，而非产生新的条带，表明超声波辅助碱处理提高了回收蛋白质的数量，而未显著改变其分子量分布。富集程度反映了细胞壁结构的固有差异：A. platensis易于释放可溶性藻胆蛋白，而Chlorella物种的坚固细胞壁限制了增溶程度。
3.3.3. 微藻蛋白浓缩物的FTIR分析
FTIR光谱显示了蛋白质相关的典型区域：酰胺A、I、II和III。优化浓缩物在酰胺区域 consistently 表现出更强的吸光度强度，表明非蛋白组分去除后相对蛋白质浓度更高。优化和对照样品之间的谱带位置 broadly 相似，表明提取过程没有从根本上改变多肽骨架或诱导主要的构象变化。FTIR分析证实，超声波辅助碱法提取通过增强增溶和浓度来提高蛋白质得率，同时保留了微藻蛋白质的特征二级结构特征。
3.4. 分离蛋白的功能特性
3.4.1. 蛋白质溶解性
蛋白质溶解性表现出强烈的pH依赖性。在去离子水中，所有浓缩物的溶解度均较低（<25%），这归因于等电点沉淀诱导的不可逆聚集。在药典缓冲体系中，溶解度在pH ≥ 7时 sharp 增加。优化效果在缓冲体系中变得明显，例如APPC-O在pH 9时达到接近完全的溶解度。这表明优化产生的功能效益只有在蛋白质分散在能够减轻沉淀诱导聚集的离子介质中时才能实现。
3.4.2. 起泡能力和泡沫稳定性
起泡性能表现出强烈的pH和物种依赖性。在对照条件下，起泡能力（FC）从中性到碱性条件（pH 7-9）显著增加（p< 0.05）。提取优化并未产生统一的改善，反而引入了产量-功能性的权衡： across 物种，FC在每种测试的pH值下 consistently 较低，而泡沫稳定性（FS）表现出更细微的反应。这种降低的FC更可能归因于胶体状态的变化（例如，空化加沉淀后形成更大/扩散性更差的聚集体），而不是严重的变性。
3.4.3. 乳化活性指数和乳液稳定性指数
乳化活性指数（EAI）和乳液稳定性指数（ESI）表现出强烈的pH依赖性，在酸性条件下界面性能较弱，在中性至碱性条件下显著增强。相对于对照，优化浓缩物表现出细微的变化：在pH 7-9下的EAI保持在较高水平但并未 uniformly 改善，而乳液稳定性（ESI）在所有三种物种的中性-碱性条件下 substantially 增加。这表明优化更改变了吸附层的质量（薄膜强度/内聚力），而不是界面区域生成的速度。
3.4.4. 吸水能力
吸水能力（WAC）在不同物种间存在差异，并受到优化提取的中等影响。在对照条件下，A. platensis表现出最高的WAC，这与SDS-PAGE显示的藻胆蛋白富集证据一致。优化后，三种浓缩物的WAC趋于一致 around ~2.5 g/g，表明加工可以协调水合行为。
3.4.5. 吸油能力
吸油能力（OAC）在不同物种间差异显著，并受到优化的强烈增强。在对照条件下，C. pyrenoidosa表现出最高的OAC。优化后，C. pyrenoidosa的OAC显著上升，而A. platensis变化很小。OAC反应的差异反映了元素分析和溶解度测试所揭示的组成差异：富含疏水域的蛋白质从破坏性提取中受益最大。
4. 结论
本研究系统评估了超声波辅助碱法从三种GRAS微藻中提取蛋白质的过程。探头超声 consistently 优于超声浴，其中A. platensis的改善最为显著。响应面优化解析了物种特异性的提取行为，而GPR通过量化预测不确定性补充了RSM。优化过程能量透明，蛋白浓缩物显示出显著的蛋白质富集（63-79%干重），SDS-PAGE和FTIR表明蛋白质特征得以保留。功能特性强烈依赖于介质/pH值：在去离子水中溶解度低，但在pH ≥ 7的缓冲液中急剧增加。不同物种在 hydration（A. platensis）和 lipid-binding（C. pyrenoidosa）方面表现出差异化特征，支持合理的配方混合策略。该研究为微藻蛋白的高效、可持续提取及其在食品工业中的应用提供了能量透明、多响应优化的框架，强调了将提取条件与对食品配方至关重要的成分性能指标联系起来的重要性。未来的研究应优先考虑感官锚定验证以及规模相关的工艺优化。
