壳聚糖和硫酸化葡聚糖纳米颗粒：一种用于保藏植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的新方法

《Food Research International》：Chitosan and sulfated glucan nanoparticles: A novel strategy for cryopreservation of Lactobacillus plantarum

本研究以壳聚糖和硫酸化β-葡聚糖复合纳米颗粒（1CH-2S-βG）为新型冷冻保护剂，通过调节浓度优化其性能，证实该纳米颗粒能降低冰晶形成温度，抑制冰晶生长，同时增强细胞膜完整性和细胞器结构稳定性，显著提高两种乳酸菌的冷冻后存活率。

　　

邓婷月|沈晓伟|韩泽宇|刘静|张博林|赵洪飞

北京林业大学生物科学与技术学院，森林食品加工与安全北京市重点实验室，森林食品资源可持续利用与开发河北省重点实验室，中国北京 100083

摘要

探索冷冻保护剂以减少乳酸菌（LAB）在冷冻过程中的细胞损伤至关重要。本研究旨在研究壳聚糖和硫酸化β-葡聚糖（CH-S-βG）纳米颗粒作为有前景的功能性冷冻保护剂候选物，并系统阐明其保护机制。选择1CH-1S-βG和1CH-2S-βG纳米颗粒（CH与S-βG的浓度比为1:1和1:2），基于它们优异的纳米颗粒尺寸（分别为197纳米和235纳米）和ζ电位（分别为13.3毫伏和15.3毫伏）。1CH-1S-βG和1CH-2S-βG均增强了蔗糖溶液的热滞后活性，降低了成核温度和冰点。具体而言，1CH-2S-βG纳米颗粒表现出更高的冰核形成抑制（IRI）活性，表现为在冷冻过程中形成更多的冰晶、更小的平均晶体表面积以及更窄的尺寸分布。这增强了细胞膜的完整性并保持了细胞内结构，从而提高了Lactobacillus plantarum CICC 22135和Lactobacillus plantarum CICC 22150的存活率。总之，1CH-2S-βG纳米颗粒作为冷冻保护剂显示出良好的潜力。

引言

乳酸菌（LAB）被认为是一种安全的益生菌，广泛应用于食品制造（Sarwar等人，2025；Wu等人，2025；Yang等人，2023）、生化产品的细胞生产（Naseeb, Rehman等人，2025）以及医疗保健领域（Aziz等人，2024；Naseeb, Sarwar等人，2025）。为了确保LAB的存活，通过冻干技术将其制备成低水分活度的干粉比其他方法更易于储存和运输（Li, Correa-González等人，2025）。然而，冻干技术可能导致不同程度的细胞损伤，如溶液效应损伤（Lovelock，1953）、机械损伤（Mazur等人，1972）、膜损伤（Wolkers等人，2018）和生物分子损伤（Tian等人，2022），从而显著降低LAB的代谢活性。因此，能够减少冷冻过程中菌株损伤并提高其存活率的冷冻保护剂已被广泛研究（Hemmati，2025；Rama等人，2019）。

传统的冷冻保护剂分为两类：可渗透性冷冻保护剂，包括DMSO和甘油；以及不可渗透性冷冻保护剂，如蔗糖和海藻糖（Chang & Zhao，2021）。在工业应用中，由于这些化合物在实现高解冻存活率和确保生物样本长期稳定性方面的可靠性，它们被广泛使用（Li, Wang等人，2025）。然而，这些行业标准保护剂存在局限性，包括含有乳制品过敏原（例如在脱脂奶中）、高浓度下的渗透损伤以及对冰晶生长的控制不足，从而降低了它们的整体效果（Jeon等人，2025；Ge等人，2024）。因此，有必要探索一种新型的非乳制品基冷冻保护剂，能够控制冰晶生长。

多糖和抗冻蛋白（AFPs）已成为这一目的的重要候选物质（Chen等人，2021）。鹰嘴豆蛋白水解物（CPH）通过增加溶解度和减少二硫键含量，改善了冷冻鱼糜的冷冻保护效果（Wang等人，2023）。尽管AFPs对冰晶具有独特的调节和修饰作用，但由于成本高、潜在的免疫原性和毒性、大规模生产挑战以及针状冰晶的形成（Liu, Dai等人，2025），它们并不总是适合用于冷冻保存。

多糖作为冷冻保护剂具有低成本、易获得和非毒性的特点，因此在食品应用中得到广泛应用（Sun等人，2023）。Karsavran等人（2025）证实，来自微藻的外多糖（EPSs）可以作为出色的冷冻保护剂，并发现添加5% EPS的Chlorella vulgaris ASYA27在10天培养后的生长速率比添加5% MeOH的组高2.1倍。

在众多天然多糖中，壳聚糖（CH）和β-葡聚糖（βG）因其独特的互补分子特性而特别值得关注，使它们成为构建新型抗冻纳米复合材料的理想组合（Zhang等人，2024）。作为唯一天然存在的带正电荷的阳离子多糖，壳聚糖的氨基赋予了其出色的成膜性能和与冰晶界面的相互作用能力（Cui等人，2024；Cui等人，2025；Shi等人，2024）。相关实验发现，壳聚糖可以在芒果表面形成一层薄膜，有效防止水分流失（Xu等人，2026）。与清水处理组相比，壳聚糖纳米复合保湿剂能更好地抑制冰晶的形成和生长，减少小龙虾的解冻损失，并保持组织结构的完整性（Sun等人，2019）。作为含有硫酸基团的多糖，硫酸化右旋糖酐具有高度亲水的硫酸基团和丰富的羟基（Chaidedgumjorn等人，2002）。这些特性使其能够通过氢键网络有效捕获水分子，从而防止重结晶（Meister等人，2014）。壳聚糖在界面调节方面的潜力，结合βG的水合/冰晶抑制能力，为在分子水平上构建多功能冷冻保护系统提供了希望，从而克服了单一多糖的性能限制（Falco等人，2017；Zhang等人，2024）。

据我们所知，关于壳聚糖和S-βG复合纳米颗粒在冷冻保存中应用的研究仍然很少。此外，以往的研究主要集中在细胞的整体存活率上，但复合多糖在冷冻过程中如何与细胞膜相互作用以稳定膜结构并防止冰晶损伤的分子机制尚不清楚。因此，本研究的目的是：（1）优化壳聚糖-S-βG纳米颗粒的浓度；（2）研究壳聚糖-S-βG纳米颗粒对Lactobacillus plantarum CICC 22135和L. plantarum CICC 22150的保护效果；（3）解释壳聚糖-S-βG纳米颗粒的保护机制。

章节片段

乳酸菌菌株的培养与制备

Lactobacillus plantarum CICC 22135、L. plantarum CICC 22150、Lactobacillus helveticus CICC 22171、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CICC 22153、Streptococcus thermophilus CICC 6332、Bifidobacterium breve CICC 6185、Bifidobacterium animalis subsp. Lactis CICC 24672和Lacticaseibacillus paracasei CICC 6263的冻干粉末由中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）购买。

Lactobacillus菌株的冻干粉末使用MRS进行培养

颗粒尺寸和ζ电位

如图1a-图1d所示，1CH-1S-βG、1CH-2S-βG、2CH-1S-βG和2CH-2S-βG的平均颗粒尺寸分别为197±1.81纳米、235±1.70纳米、286±2.43纳米、353±2.04纳米。值得注意的是，1CH-1S-βG（0.15）和1CH-2S-βG（0.17）的多分散指数（PDI）显著低于2CH-1S-βG（0.27）和2CH-2S-βG（0.26）。随着CH和S-βG浓度的增加，壳聚糖-S-βG纳米颗粒的尺寸持续增大。在中性环境中，

结论

本研究显示，壳聚糖-S-βG纳米颗粒，特别是1CH-2S-βG配方，对Lactobacillus plantarum CICC 22135和L. plantarum CICC 22150表现出优异的冷冻保护效果。1CH-2S-βG纳米颗粒具有最佳的物理化学性质（更小的尺寸、更低的PDI和更高的ζ电位）。1CH-2S-βG纳米颗粒通过两种机制确保了LAB在冷冻过程中的存活：在细胞外，通过降低冷冻前的成核温度和增强IRI

CRediT作者贡献声明

邓婷月：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，软件，方法学，调查，数据管理。沈晓伟：监督，资源，方法学，资金获取，正式分析，概念化。韩泽宇：可视化，项目管理，方法学，调查，数据管理。刘静：可视化，监督，软件，资源，正式分析。张博林：可视化，验证，资源，资金获取，正式

未引用参考文献

Budke和Koop，2006b

Guo等人，2025b

Suris-Valls和Voets，2019

Zhao, Zhang, Hu, Liu和Han，2017

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。