Staphylococcus vitulinus蛋白酶的功能评估：生化特性、结构适应性及其在肌原纤维蛋白中的应用

《Food Research International》：Functional evaluation of a Staphylococcus vitulinus protease: Biochemical properties, structural adaptation, and application in myofibrillar proteins

枯草芽孢杆菌蛋白酶水解肌肉蛋白提升风味形成机制研究，其最适pH8.0和50℃，Mn2+增强活性而其他金属离子抑制，动力学参数显示Km=9.67 mg/mL，Vmax=27.5 U/mL·min，ΔH*=?13.94 kJ/mol。结构分析表明pH/温度变化通过三级结构（酪氨酸/色氨酸残基）及二级结构（α螺旋/β片层减少）影响活性。水解后显著提高肌肉蛋白水解度（P<0.05）、溶解度和多肽浓度，并生成醇类、酯类等风味物质。

　　

范宇航|陈倩|刘倩|王慧|孙芳达|孔宝华

中国黑龙江省哈尔滨市东北农业大学食品科学学院，邮编150030

摘要

从Staphylococcus vitulinus中分离出一种胞外蛋白酶，该蛋白酶在pH 8.0和50°C条件下表现出最佳活性。Mn²⁺（10 mmol/L）显著增强了其活性，而Zn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺和Fe³⁺则表现出抑制作用（P < 0.05）。该蛋白酶的Km和Vmax值分别为9.67 mg/mL和27.5 U/mL·min，Ea值为16.5 kJ/mol。来自S. vitulinus的蛋白酶的ΔH*为13.94 kJ/mol，ΔG*为39.18 kJ/mol，ΔS*为?70.9 J/(mol·K)。荧光和紫外光谱分析表明，pH值和温度的变化通过影响蛋白质的三级结构来改变其活性，这主要与酪氨酸和色氨酸残基有关。在二级结构层面，蛋白酶活性的下降与α-螺旋和β-折叠结构的减少以及无规卷曲结构的增加有关。S. vitulinus蛋白酶催化的蛋白水解显著提高了肌原纤维蛋白（MPs）的水解程度、溶解度和肽浓度（P < 0.05），其中最高水解率出现在0–30分钟内。随着水解时间的延长，游离氨基酸的种类和含量也有所增加（P < 0.05）。蛋白酶处理促进了MPs衍生物中挥发性化合物的形成，包括醇、酯、醛、酸和酮。选取了6种在投影值大于1的挥发性化合物。本研究旨在开发一种具有优异蛋白水解能力和风味增强效果的蛋白酶，并从氨基酸代谢途径的角度阐明其作用机制。

引言

哈尔滨干香肠是一种传统的中国东北地区手工制作的开放式发酵肉制品，经过大约10天的发酵后，会形成独特的香气和细腻的质地。肌原纤维蛋白（MPs）约占肉蛋白的50%，在维持肌肉结构的完整性和塑造肉的品质特征方面起着关键作用（Liu等人，2025年）。作为肉类加工过程中的典型生化反应，肌肉蛋白的水解对最终产品的质地、口感和风味有显著影响（Li等人，2024年）。在干燥腌制过程中，内源性蛋白酶的活性往往不稳定且容易受到环境因素的抑制。因此，发酵肉制品中的蛋白质水解在很大程度上依赖于有益微生物分泌的蛋白酶与内源性蛋白酶的共同作用（Li等人，2025年）。由于发酵肉生产中的腌制和发酵过程相似，微生物群落结构也相似，主要包括葡萄球菌、乳酸菌、微球菌、酵母和霉菌（Fan, Badar等人，2025年）。

作为发酵肉中主要的细菌菌株，Staphylococcus和乳酸菌能够很好地适应高盐和酸性环境。其中，Staphylococcus通过碳水化合物发酵、氨基酸转化、脂质β-氧化和酯酶活性参与最终风味的形成（Fan, Badar等人，2025年）。大多数葡萄球菌能够产生蛋白酶和氨基肽酶，它们的优异蛋白水解能力约占肉制品发酵过程中蛋白水解总量的40%（Sánchez Mainar等人，2017年）。Staphylococcus xylosus和S. carnosus常被用作发酵剂，因为它们对发酵肉的颜色、质地和风味有积极影响。此外，S. vitulinus具有GRAS（安全、良好食用）认证，使其在肉制品中的使用更受消费者欢迎。与S. xylosus相比，Wu等人（2023年）发现接种S. vitulinus可显著增加干腌肉中的肽和游离氨基酸含量（P < 0.05）。Shi等人（2024年）观察到，接种S. xylosus和S. vitulinus的干腌鸭中醛类物质的含量显著增加，氨基酸和脂质代谢是葡萄球菌的主要代谢途径。这表明S. vitulinus具有很强的蛋白水解能力，这与它的高蛋白酶产量密切相关。研究表明，接种S. vitulinus可显著增强腌制猪肉中组织蛋白酶B?+?L、H和丙氨酰氨基肽酶的活性（Zhou等人，2024年）。与商业发酵剂相比，从发酵肉中分离出的葡萄球菌菌株更能适应肉的发酵环境，因此是优质的葡萄球菌来源（Sun, Sun等人，2019年）。

许多早期研究集中在微生物蛋白酶的纯化上，以研究它们的酶学性质和对肉蛋白的水解能力（Sun, Sun等人，2019年；Wang, Xu, Kong等人，2022年）。Wang, Liu等人（2021年）从S. epidermidis BP9中分离出一种约24 kDa的胞外蛋白酶，并证明该蛋白酶能够将肉蛋白水解成细小颗粒。然而，关于加工相关环境压力对蛋白酶功能及其在风味形成中的潜在作用的研究较少。本研究的目的是鉴定和表征从哈尔滨干香肠中分离出的S. vitulinus蛋白酶，并进一步评估其酶学性质。在此基础上，研究了不同环境条件对蛋白酶结构及其相关应激反应机制的影响。最后，研究了S. vitulinus蛋白酶水解MPs所导致的风味化合物形成的动态变化。这项实验有助于从葡萄球菌蛋白酶的角度阐明发酵机制，并为新型发酵剂提供了潜在的来源。

细菌培养和材料

S. vitulinus是从哈尔滨干香肠中分离得到的，先前的研究已证实它具有出色的蛋白酶产生能力。该菌株通过16S rDNA序列进行鉴定，并储存在?80°C条件下。

除2-甲基-3-庚酮（色谱级）外，所有其他试剂均为分析级。在本研究中，2-甲基-3-庚酮（色谱级）由Anpel Experimental Technology Co., Ltd.（上海，中国）提供。其他试剂均为分析级。

蛋白酶的纯化

如表1所示，粗蛋白酶提取物的总蛋白水解活性为297.5 U。经过硫酸铵沉淀和透析后，部分纯化的蛋白酶的比活性达到10.17 U/mg，纯化倍数约为5.71倍，回收率为67.1%。蛋白酶活性的增加可能归因于在不同盐浓度下蛋白酶与非蛋白酶蛋白质在各个组分中的溶解度差异及相对富集。

风味形成讨论

图6展示了S. vitulinus蛋白酶对MPs的潜在降解和风味形成途径。作为重要的风味前体，MPs在酶催化下高效水解，因为活化能降低。随后，通过肽酶和氨基肽酶的作用，水解产物被转化为小肽和游离氨基酸。其中，分子量低于3 kDa的肽被认为有助于甜味、苦味、酸味、鲜味等风味的形成。

结论

本研究从哈尔滨干香肠中分离出的S. vitulinus中纯化出一种胞外蛋白酶，并评估了其生化性质和风味形成潜力。结果表明，S. vitulinus蛋白酶在pH 8和50°C条件下表现出最大活性，具有良好的热稳定性和有效的底物结合能力。其酶活性也受到不同金属离子的影响。pH值和温度变化会导致其三级和二级结构的变化。

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。

作者贡献声明

范宇航：撰写——初稿、数据整理。陈倩：数据整理。刘倩：实验研究、数据分析。王慧：软件使用、资源准备。孙芳达：撰写——审稿与编辑、概念构思。孔宝华：指导、方法设计、资金申请、概念构思。

未引用参考文献

Wen等人，2023年

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（U22A20547）的资助。