维生素B6和胆碱对β-乳球蛋白美拉德反应的缓解作用：通过质谱技术和相互作用分析揭示其作用机制

《Food Research International》：The alleviating effects of vitamin B6 and choline on β-lactoglobulin Maillard reaction: Insight into the mechanisms via mass spectrometry and interaction analysis

本研究探讨维生素B6和胆碱对β-乳球蛋白美拉德反应的抑制效果，通过分析反应指标、结构变化、糖化位点及分子间作用，发现两者均有效抑制AGEs生成，并影响蛋白荧光特性及二级结构，其机制与氢键及疏水作用相关。

　　

王梦琪|王思慧|李聪|李红娟|李洪波|余京华

天津科技大学食品科学与工程学院，中国天津300457

摘要

本研究通过表征反应指标、结构变化、糖基化位点和分子间相互作用，探讨了维生素B6（VB6）和胆碱对β-乳球蛋白（β-Lg）美拉德反应的抑制作用。结果表明，乳糖诱导的糖基化导致β-Lg中游离氨基含量减少，并促进了晚期糖基化终产物（AGEs）的形成。补充VB6和胆碱后，游离氨基含量分别增加了1.5倍和0.7倍，AGEs的抑制率分别达到了28.28%和7.42%。光谱分析显示，乳糖诱导的糖基化使β-Lg的荧光残基暴露在更极性的环境中，导致荧光淬灭。VB6的存在进一步增强了荧光淬灭现象，并伴随最大发射波长的红移。相比之下，添加胆碱抑制了糖基化引起的荧光淬灭，并稳定了β-Lg的结构。此外，傅里叶变换红外光谱（FITR）分析表明，特征峰向低波数方向移动，同时次级结构也发生了变化。液相色谱-质谱（LC-MS/MS）分析显示，VB6和胆碱降低了特定位点（如Lys75）的糖基化程度。分子对接分析揭示，VB6和胆碱通过氢键和疏水相互作用与β-Lg结合。Lys残基可及性的限制可能是VB6和胆碱抑制糖基化的关键机制。

引言

婴儿配方奶粉（IF）主要由蛋白质、乳糖、维生素和微量元素组成，通过灭菌、浓缩和喷雾干燥步骤生产（Masum等人，2021年）。其复杂的成分、强烈的热处理以及不稳定的储存条件使得IF特别容易发生美拉德反应（MR）（Birlouez-Aragon等人，2004年）。这种反应可能通过糖基化降低赖氨酸的可用性，并产生有害化合物，从而影响婴儿的新陈代谢和免疫力。MR的早期阶段表现为赖氨酸含量的减少（Wang等人，2023年）。在中期阶段，会形成糠醛和酮衍生物，如5-羟甲基糠醛（5-HMF）和α-二羰基化合物。美拉德反应产物（MRPs）进一步缩合为晚期糖基化终产物（AGEs），包括N-羧甲基赖氨酸（CML）和N-羧乙基赖氨酸（CEL）（Wei等人，2024年）。大量研究表明，AGEs可能引发炎症和氧化应激，从而增加慢性疾病的风险，包括认知功能障碍和心血管疾病（Li等人，2022年）。因此，调节IF中的MR程度至关重要。

β-乳球蛋白（β-Lg）含有162个氨基酸残基，分子量约为18.4 kDa，占乳清蛋白总量的50-55%（Tu等人，2022年）。在IF中添加β-Lg是为了达到乳清蛋白与酪蛋白的比例为6:4。然而，与酪蛋白相比，β-Lg含有15个赖氨酸残基和一个N端氨基，这使得它更容易在IF中发生MR，从而导致营养损失（Fenaille等人，2004年）。此外，β-Lg具有由八个反平行β链和一个α螺旋组成的杯状结构，这有利于疏水性和亲水性配体的结合（Morgan等人，1999年）。脂溶性维生素、脂肪酸、多酚和黄酮类物质可以通过非共价相互作用调节β-Lg的结构和功能特性（Fu等人，2023年；Le Maux等人，2014年；Xu等人，2019年）。β-Lg-还原糖模型系统被广泛用于研究小分子生物活性物质的抗糖基化作用（Wang等人，2021年）。因此，选择β-Lg作为目标蛋白来研究MR的抑制作用。

抑制MR被认为是减少AGEs的有效策略。常见的MR抑制机制包括：(a) 与反应物竞争以降低其可用性；(b) 清除自由基以抑制氧化链反应并减缓AGE的形成；(c) 捕获活性中间体，如有毒的二羰基化合物（例如乙二醛、甲基乙二醛）；(d) 形成非共价复合物，改变蛋白质构象并减少糖基化位点的暴露（Lund & Ray，2017年）。天然小分子如儿茶素、茶黄素和柚皮苷已被报道可以有效清除甲基乙二醛，从而抑制MR（Kathuria等人，2023年）。然而，这些化合物尚未获准用于IF。在IF中的内源性成分中，维生素C和维生素E具有很强的抗氧化活性，能有效清除过氧自由基，从而抑制Amadori产物的氧化（Chen等人，2021年）。关于其他必需维生素在IF中对MR进展的影响的研究仍然有限。维生素B6（VB6）有三种形式：吡哆醇、吡哆胺和吡哆醛，其中吡哆胺和吡哆醛已被证明可以抑制MR（Mazumder等人，2019年；Voziyan & Hudson，2005年）。然而，添加到IF中的VB6形式是盐酸吡哆醇，其抑制作用和机制尚不清楚。根据中国《婴儿配方奶粉国家标准》（GB 10765–2021），胆碱在维生素中的允许添加量最高（4.8–23.9 mg/100 kJ）。此外，由于其季铵基团，胆碱可以作为有机阳离子，形成能够稳定蛋白质系统的离子液体。添加到IF中的常见胆碱化合物胆碱酒石酸盐已被报道可以增强β-Lg的热稳定性和结构稳定性（Sindhu等人，2019年）。基于先前的研究发现，VB6（吡哆胺和吡哆醛）可以抑制MR，而胆碱可以稳定蛋白质系统，本研究假设VB6（吡哆醇）和胆碱（胆碱酒石酸盐）可能有助于抑制IF中的MR。

在本研究中，基于IF中约50%的乳糖含量，建立了β-Lg-乳糖MR系统。通过测定游离氨基和AGEs的含量来评估MR的程度。进一步使用光谱技术表征了VB6和胆碱对β-Lg构象和微环境的影响。通过LC-MS/MS分析了β-Lg的糖基化位点和程度，以阐明VB6和胆碱的抗糖基化作用。本研究为IF中MR的抑制提供了新的见解。

部分内容片段

化学品

来自Sigma（圣路易斯，MO）的β-Lg（纯度≥90%）。VB6（5%吡哆醇，0.27%柠檬酸，2.53%柠檬酸钠，92.2%麦芽糊精）和胆碱（100%胆碱酒石酸盐）购自JKP Nutrition（北京，中国）。邻苯二甲醛（OPA）、8-氨基-1-萘磺酸（ANS）、甲酸和乙腈购自Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.（上海，中国）。去离子水（ddH?O）使用Milli-Q系统纯化（Millipore）。

游离氨基

MR是指蛋白质的游离氨基与还原糖的羰基之间的缩合和聚合反应，导致各种MRPs的形成（Wang等人，2022年）。随着MR的进行，游离氨基含量减少。如图1A所示，β-Lg-乳糖系统的游离氨基含量最低（0.034 ± 0.001 mg/mL）。在β-Lg-聚葡萄糖系统中也观察到了与羰基结合的游离氨基的可用性降低。

结论

VB6（吡哆醇）和胆碱（胆碱酒石酸盐）是IF中的必需维生素。本研究使用光谱和质谱技术研究了VB6和胆碱在模拟IF的乳糖-β-Lg系统中对MR的抑制作用。VB6和胆碱有效地减弱了MR。从机制上看，它们通过插入β-Lg的疏水腔中改变Tyr和Trp残基的微环境，同时形成氢键和疏水相互作用。

CRediT作者贡献声明

王梦琪：撰写——原始草稿，概念构思。王思慧：验证，研究。李聪：验证。李红娟：资源提供。李洪波：监督，正式分析。余京华：监督，资源提供。

未引用参考文献

Tu, Zhong and Wang, 2017

致谢

作者感谢天津科技计划项目[项目编号：23YDTPJC00340]和天津科技大学优秀博士论文创新项目的支持（YB22942006）。同时，感谢天津科技大学现代分析技术研究中心提供的F-7100荧光分光光度计的支持。

利益冲突声明。

本提交内容不存在利益冲突