《Immunobiology》：Unmodified γδ T cells exhibit potent antitumor activity in hepatocellular carcinoma and are enhanced by PD-L1 blockade
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本研究针对肝细胞癌(HCC)免疫抑制微环境限制现有免疫疗法疗效的难题，探讨了未修饰γδ T细胞的抗肿瘤活性及PD-1/PD-L1轴对其疗效的调控机制。通过体外共培养模型和皮下异种移植小鼠实验，发现γδ T细胞对HCC细胞具有剂量依赖性细胞毒性，但在PD-L1高表达肿瘤中会诱发适应性免疫抵抗；PD-L1阻断可恢复其肿瘤控制能力。该研究为γδ T细胞疗法联合免疫检查点抑制提供了机制依据，对推进晚期HCC治疗具有重要意义。
肝细胞癌(HCC)是全球范围内发病率和死亡率均居高不下的恶性肿瘤，尤其多数患者确诊时已处于晚期，失去了手术根治的机会。尽管以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫疗法为晚期HCC带来了希望，但其总体应答率仍有限，这主要归因于HCC高度免疫抑制的肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)。该微环境中充斥着免疫抑制性细胞和分子，使得传统的αβ T细胞容易耗竭，从而限制了免疫治疗的效果。因此，寻找能够突破这种免疫抑制屏障的新型免疫效应细胞，成为当前HCC治疗研究的热点。
在此背景下，γδ T细胞因其独特的抗肿瘤特性而备受关注。与αβ T细胞不同，γδ T细胞具有主要组织相容性复合体(MHC)非依赖性的肿瘤识别能力、较低的基础PD-1表达水平以及产生强效促炎细胞因子（如IFN-γ和TNF-α）的能力，使其理论上能更好地对抗免疫抑制性TME。然而，未经过基因修饰的、天然扩增的γδ T细胞在HCC中的具体抗肿瘤效果、持久性以及其功能是否会受到HCC微环境（特别是PD-L1表达）的影响，尚需系统性的临床前评估。发表在《Immunobiology》上的这项研究，正是为了回答这些关键问题。
为了全面评估未修饰γδ T细胞在HCC中的治疗潜力，研究人员综合运用了多种技术方法。首先，他们利用生物信息学分析了肝癌(LIHC)公共数据集，筛选与预后相关的T细胞受体γ可变区(TRGV)基因。在实验层面，研究团队从健康人外周血单核细胞(PBMC)中扩增获得未修饰的γδ T细胞，并选用PD-L1表达水平不同（Huh7为PD-L1低表达，HCC-LM3为PD-L1高表达）的两种人HCC细胞系进行体外功能实验。这些实验包括：Caspase 3/7活性检测以评估细胞凋亡；xCELLigence实时细胞分析(RTCA)系统动态监测肿瘤细胞活力和γδ T细胞的杀伤动力学；以及多重细胞因子检测分析共培养上清中的免疫分子分泌情况。在体内研究中，他们构建了裸鼠皮下荷瘤模型，通过两种给药途径（γδ T细胞与肿瘤细胞共注射，或待肿瘤建立后经尾静脉系统性输注）来评估其抗肿瘤效果、免疫检查点分子的调控以及系统性安全性。此外，还采用了蛋白质印迹(Western Blot)、实时定量PCR(RT-qPCR)和免疫荧光染色等技术来探究潜在分子机制。
3.1. TRGV3是T细胞浸润的预后指标且在HCC中下调
研究人员首先通过生物信息学分析发现，在T细胞受体γ可变区基因中，TRGV3的表达与HCC患者较好的总生存期显著相关。单细胞RNA测序数据证实，TRGV3的表达特异性地定位在肿瘤微环境中的NK/T细胞群，而非肿瘤细胞本身。这表明TRGV3可以作为反映肿瘤内γδ T细胞浸润和功能的替代标志物。临床数据分析显示，TRGV3高表达组患者生存期更长，而其在下调则提示HCC微环境抑制了γδ T细胞的抗肿瘤免疫。
3.2. 未修饰γδ T细胞的体外抗肿瘤活性和免疫刺激作用
体外实验结果表明，未修饰γδ T细胞对Huh7和HCC-LM3细胞均表现出强大的、剂量依赖性（效应细胞:靶细胞, E:T比率）的细胞毒性，显著诱导了肿瘤细胞的Caspase 3/7活化（即凋亡）。同时，共培养上清中促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α的水平显著升高。实时细胞分析进一步揭示，γδ T细胞能有效杀伤两种HCC细胞，但在针对PD-L1高表达的HCC-LM3细胞时，其杀伤动力学出现延迟，且后期出现肿瘤细胞复发现象，提示可能存在适应性抵抗机制。
3.3. 未修饰γδ T细胞在体内抑制HCC肿瘤生长且疗效呈PD-L1依赖性
在裸鼠皮下移植瘤模型中，当γδ T细胞与HCC细胞（无论是Huh7还是HCC-LM3）直接混合后共注射时，均能有效抑制肿瘤生长，呈现剂量依赖性。然而，当肿瘤建立后，通过尾静脉系统性输注γδ T细胞时，其在PD-L1低表达的Huh7模型中依然有效，但在PD-L1高表达的HCC-LM3模型中，抑瘤效果则大打折扣。免疫荧光染色证实了两种模型体内PD-L1表达的差异。这说明PD-L1阳性肿瘤微环境会削弱系统性输注的γδ T细胞的疗效。
3.4. 阻断PD-L1/PD-1轴增强γδ T细胞对HCC细胞的细胞毒性
机制探索发现，γδ T细胞与HCC细胞（特别是HCC-LM3）共培养后，会诱导肿瘤细胞表面PD-L1蛋白表达显著上调，同时γδ T细胞自身的PD-1 mRNA表达也增加。这形成了一个免疫抑制反馈环路。功能挽救实验证明，在体外共培养体系中加入PD-L1中和抗体，可以显著增强γδ T细胞对HCC-LM3细胞的杀伤能力，尤其是在高E:T比率下效果更为明显。这表明阻断PD-1/PD-L1通路能够逆转肿瘤诱导的γδ T细胞功能抑制。
3.5. 未修饰γδ T细胞在体内具有良好的耐受性且无明显毒性
对接受γδ T细胞治疗的荷瘤小鼠进行全面的血液学和血清生化指标分析，结果显示所有参数均在正常参考范围内，未观察到明显的系统性毒性反应。尽管个别红细胞指数（如平均红细胞体积MCV和平均红细胞血红蛋白浓度MCHC）有轻微变化，但被认为可能与免疫激活相关的炎症状态有关，不构成临床意义上的毒性。小鼠体重监测也未发现治疗相关的不良影响。这证明了未修饰γδ T细胞体内应用的初步安全性。
综上所述，本研究得出核心结论：未修饰的γδ T细胞本身对HCC具有强大的抗肿瘤活性，并展现出良好的安全性。然而，其疗效，特别是在系统性给药时，会受到肿瘤微环境适应性免疫抵抗的限制，具体表现为γδ T细胞攻击所触发的肿瘤PD-L1上调和γδ T细胞自身PD-1表达增加所形成的负反馈环路。重要的是，阻断PD-L1/PD-1轴可以克服这一限制，恢复并增强γδ T细胞的肿瘤杀伤功能。
在讨论中，作者强调了该研究的转化医学意义。它将γδ T细胞这一有前景的天然免疫效应细胞与已广泛应用于临床的免疫检查点抑制剂联系起来，为治疗PD-L1阳性、对现有免疫疗法应答不佳的晚期HCC患者提供了一种新的联合治疗策略。与需要复杂基因工程改造的CAR-T细胞相比，未修饰γδ T细胞疗法可能具有“现货供应”、成本相对较低和毒性可控等潜在优势。因此，这项研究不仅深化了对γδ T细胞与肿瘤微环境相互作用的理解，更重要的是为推进γδ T细胞联合PD-1/PD-L1抑制剂治疗HCC的临床开发提供了坚实的临床前证据和理论依据。
