《International Journal of Antimicrobial Agents》：CRISPR/Cas9-Engineered
Salmonella Phage Displaying Antimicrobial Peptide LL37 for Enhanced Antibacterial Activity
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噬菌体工程增强抗菌肽LL37的抑菌效果及安全性研究，证实其能有效抑制耐药沙门氏菌再生并提升动物模型保护率，且无细胞毒性。
苏珍珠（Su Jin Jo）|朴世昌（Se Chang Park）|金尚根（Sang Guen Kim）
韩国首尔国立大学兽医学院水生生物医学实验室及兽医科学研究所，08826
摘要
耐抗生素的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）的日益普遍，凸显了迫切需要替代性治疗策略。本研究评估了一种基因工程噬菌体对鼠伤寒沙门氏菌的抗菌效果，该噬菌体表达了具有抗菌活性的LL37肽。尽管在病毒颗粒结构中表达了LL37，但这种工程噬菌体仍表现出与野生型噬菌体相当的热稳定性和pH稳定性。值得注意的是，其抗菌活性得到了增强，主要归因于吸附率的提高。在细胞裂解实验中，工程噬菌体能够持续抑制细菌24至72小时，而野生型噬菌体由于产生了抗噬菌体突变体而使细菌重新生长。在上皮细胞相互作用实验中，工程噬菌体显著减少了细菌的附着和内化。此外，细胞内存活实验表明，工程噬菌体有效降低了细菌在宿主细胞中的持续存在。在体内预防性实验中，工程噬菌体以剂量依赖的方式显著提高了Galleria mellonella感染模型中幼虫的存活率，其保护效果是野生型噬菌体的100倍。值得注意的是，在细胞或动物水平上均未观察到显著的细胞毒性，这支持了工程噬菌体的安全性和治疗潜力。这些发现表明，噬菌体工程是一种提高抗菌效果和对抗耐抗生素细菌感染的有前景的策略。
引言
沙门氏菌是导致人类和动物食物中毒的主要全球病原体[1]。在其血清型中，鼠伤寒沙门氏菌是胃肠炎和全身性感染的主要原因，对免疫系统受损的个体构成重大风险[2]。感染通过受污染的食物或水传播，导致细菌侵入肠道上皮细胞并引发炎症反应[3]。如果不加以治疗，全身性感染可能扩散到肝脏、脾脏和骨髓等器官，可能导致多器官衰竭[4]。耐抗生素现象的日益普遍进一步加剧了治疗的复杂性，凸显了替代性治疗方法的必要性。
噬菌体是一种能够选择性攻击细菌的病毒，为传统抗生素提供了一种天然且精确的替代方案，尤其是在耐抗生素现象日益严重的背景下[5]。与传统基于抗生素的治疗方法不同，噬菌体具有高特异性，并且对有益微生物群的损害较小[6]。噬菌体疗法已成功用于治疗由ESKAPE病原体引起的感染，一些基于噬菌体的治疗方法正在进行临床试验[7]。此外，噬菌体还被成功应用于食品安全领域，以减少家禽产品中的
沙门氏菌污染，从而为控制食源性病原体提供了有针对性的方法[8]。然而，天然噬菌体可能受到细菌耐药性的限制，或者噬菌体-细菌-宿主之间的相互作用较弱，吸附和感染效率不佳。为了克服这些挑战，人们通过基因工程改造噬菌体以提高其抗菌活性和宿主相互作用，从而增强其治疗潜力[6]。
分子生物学的进步使噬菌体工程能够超越其天然能力，提升其治疗潜力[9]。基因修饰可以增强抗菌效果，而CRISPR-Cas技术通过实现精确的基因重组和靶向选择，彻底改变了噬菌体的设计[10]。工程噬菌体在对抗
大肠杆菌、
单核细胞增生李斯特菌和
艰难梭菌感染方面表现出更强的清除能力，其中一些噬菌体（如LBP-EC01）已进入临床评估阶段[11,12,13]。这些进展表明，工程噬菌体作为下一代抗菌剂在对抗耐抗生素细菌感染方面具有巨大潜力[14]。
本研究旨在通过改造噬菌体使其结构上表达LL37肽来增强其对鼠伤寒沙门氏菌的疗效。我们进行了体外和体内分析，以评估其增强的生物学特性和治疗潜力。我们的方法旨在证明噬菌体工程是一种对抗耐抗生素感染的创新策略，并探索其在靶向沙门氏菌治疗中的临床应用前景。
实验部分
微生物培养条件和制备
本研究使用了多重耐抗生素的沙门氏菌肠炎亚种鼠伤寒沙门氏菌DT104（美国典型培养物收藏中心（ATCC）700408）及其专性裂解噬菌体。该菌株对氨苄西林、氯霉素、链霉素、磺胺类药物和四环素具有抗性，是评估抗生素替代方案的代表性多重耐药（MDR）模型[15]。野生型噬菌体被命名为pST_PMR_01（φWT）。
工程噬菌体的生物学特性
透射电子显微镜（TEM）分析显示，pST_PMR_01属于Straboviridae噬菌体家族，具有二十面体衣壳（111.53 ± 2.57 nm）和可收缩的尾部（128.56 ± 4.61 nm）（图2A）。衣壳中表达的LL37并未改变噬菌体的大小（头部110.77 ± 1.68 nm，尾部127.44 ± 4.29 nm）（图2B），也不影响其在不同温度和pH值下的稳定性（p > 0.05），表明LL37的整合并未影响其结构完整性（图3）。两种噬菌体在4°C、27°C和37°C下均保持稳定，仅观察到滴度略有下降。
讨论
随着耐抗生素现象的加剧，噬菌体疗法已成为传统抗生素的有希望的替代方案。基因工程的进步扩展了噬菌体的抗菌功能，使其能够靶向β-内酰胺酶和毒力因子[26]。在此基础上，本研究旨在通过将LL37肽表达在病毒颗粒表面来增强噬菌体的抗菌活性并限制耐药性的发展。据我们所知，这是首次尝试
资助
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）基础科学研究计划的支持，该计划由教育部资助（RS-2022-NR075245）。
