染色质阅读器-核小体相互作用的多价性直接读取：核小体质谱技术的突破与应用

《ACS Central Science》：Direct Readout of Multivalent Chromatin Reader-Nucleosome Interactions by Nucleosome Mass Spectrometry

本文系统介绍了核小体质谱（Nuc-MS）这一原生自上而下质谱技术，该技术能够直接解析染色质相关蛋白（CAP）与完整核小体（nuc）的多价相互作用。通过控制CAP:nuc复合物的解离及组蛋白蛋白形式（proteoform）分析，Nuc-MS克服了传统肽段研究无法反映多位点结合调控潜力的局限。研究证实BPTF的PHD-BD串联阅读器可协同识别完全定义的（[H3K4me3K9acK14acK18ac]2）核小体，并进一步揭示BRD4、DNMT3A-MPP8及PtSHL等串联阅读器与内源性HeLa核小体结合时富集的独特组蛋白修饰模式，为表观遗传调控机制提供了全新视角。

引言部分系统阐述了核小体作为真核生物基因组组织基本单元的组成与功能。典型核小体由核心组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）各两个拷贝形成蛋白质八聚体，外裹147bpDNA构成。组蛋白球状折叠结构域介导与DNA的广泛结构关联，而带电荷的N端尾部则动态参与核小体内及核小体间的表面相互作用。组蛋白翻译后修饰（PTM）为重复单元引入多样性，不同修饰形式与序列变体共同构成“组蛋白蛋白形式”（proteoform），其在不同核小体中的组合则形成“核小体形式”（nucleoform）。位点特异性PTM通过特化阅读器结构域（如识别未修饰/甲基化赖氨酸的植物同源结构域PHD、识别乙酰化赖氨酸的溴结构域BD）成为染色质相关蛋白（CAP）的识别位点。理解CAP与核小体相互作用对解析DNA复制、转录、修复等核心过程至关重要，其调控异常与发育障碍、癌症、神经退行性疾病密切相关。

传统研究多采用组蛋白肽段下拉、阵列或结构预测等方法，但这些简化模型难以真实反映CAP:nuc复合物的调控潜力，且无法模拟跨核小体组蛋白的相互作用（反式作用）。此外，组蛋白肽段缺乏某些阅读器结构域（如PWWP、特定BD）有效结合所需的核小体DNA环境，也无法提供支持多价结合的非特异性表面（如核小体DNA缠绕区、酸性斑块）。半合成PTM定义核小体虽能提供更真实靶标，但化学合成成本高昂难以覆盖组蛋白形式的巨大多样性。因此，亟需无需先验知识即可筛选CAP与核小体结合、并能鉴定驱动结合的组蛋白形式的新方法。

质谱技术虽极大促进了对CAP:nuc相互作用的理解，但传统自下而上方法需将复合物变性酶解为短肽，丢失了CAP复合物组成及非相邻PTM共现信息。自上而下质谱通过直接分析完整蛋白质可提供包含变体身份及远端PTM组合的完整组蛋白形式信息。原生自上而下质谱指可控解离蛋白质复合物并后续表征所含蛋白形式的技术。核小体质谱作为原生自上而下方法，可从半合成或内源性核小体中获取蛋白质组成及组蛋白形式信息。本研究采用新命名法以准确传达蛋白形式/核小体形式水平数据及实验确定度。

结果与讨论部分详细展示了Nuc-MS工作流程，包括原生CAP:nuc复合物的完整质量分析、弹出组蛋白的完整质量分析及富集群组蛋白形式的串联质谱碎裂鉴定。研究使用Orbitrap Q-Exactive超高质量范围及Orbitrap Tribrid质谱仪，因其高达800kDa的质量分析范围适于研究完整CAP:nuc复合物。实验通过CAP介导的核小体富集及充分洗涤降低样品复杂度，聚焦于驱动结合的等重形式区分，并特意选择串联阅读器以研究最具亲和力及生物学意义的组合结合。

以BPTF PHD-BD串联阅读器为例，Luminex实验证实其偏好结合H3_[1–20]K4me3及H3_[1–20]K4me3K9acK14acK18ac肽段，但在核小体背景下强烈偏好完全定义的（[H3K4me3K9acK14acK18ac]₂）组合。Nuc-MS分析显示BPTF不能稳定结合未修饰、单修饰或乙酰化修饰核小体，但有效结合（[H3K4me3K9acK14acK18ac]₂）核小体。功能丧失突变进一步证实PHD指状结构或溴结构域任一失活均阻碍复合物形成。质谱解离验证了各组蛋白形式的身份及PTM，提示复合物中可能包含通过N端GST标签二聚化的两个BPTF分子结合单个核小体H3尾部。

研究进一步将Nuc-MS应用于内源性核小体的CAP富集分析，发现不同串联阅读器回收 distinct 组蛋白形式景观。BRD4 BD1-BD2富集超乙酰化H4形式，包括单、双、三乙酰化形式的显著增加，串联质谱鉴定出K5、K8、K12、K16乙酰化与K20me2的组合，以及此前未与BRD4经典功能关联的H4K44ac，可能反映其在DNA损伤修复中的作用。H3.2形式未见明显变化，但H2A.Z变体的乙酰化形式H2A.ZK15ac约富集1.75倍。这些发现突破了肽段中心研究的认知局限。

DNMT3A-MPP8嵌合阅读器融合了H3K36me2/3结合PWWP结构域与H3K9me3结合染色质结构域，其富集的内源性核小体显示H3.2形式中四及以上甲基当量形式增加1.5倍。通过变性液相色谱-自上而下质谱及平行反应监测，解析出复杂混合物中的主要形式包括H3.2K9me2K36me3及H3.2K9me2K27me3等，符合标记 poised 转录增强子的“二价”状态特征。其他组蛋白中鉴定出与活跃转录相关的H4K16acK20me2组合，H2A/H2B形式无显著变化。

Populus trichocarpa短半衰期蛋白PtSHL的BAH-PHD串联阅读器可识别H3K4me3与H3K27me3，其富集的内源性核小体显示H3.2甲基当量形式增加，而其他组蛋白形式与批量HeLa相似。深入分析发现6x及9x甲基当量形式中存在顺式二价修饰H3.2K4me2/3K27me2/3，此前仅报道反式异型二价标志。Luminex滴定实验显示PtSHL对同型及异型靶标均表现出对（[H3K4me3K27me3]₂）的强烈偏好，提示其能从染色质中富集少量顺式二价靶标。该发现可能代表未被充分认识的生物学可能性或HeLa细胞长期积累基因组畸变导致的染色质景观失调。

结论部分指出，Nuc-MS为直接解析CAP与染色质景观的功能关系提供了强大工具，能够剖析不同组蛋白形式对CAP结合的相对贡献。研究通过四个串联阅读器CAP:nuc复合物的蛋白形式景观分析，证实了该技术在商业化 Orbitrap 质谱平台上的实用性。每个案例均验证已知相互作用的同时，揭示了可作为后续基因组研究基础的 novel 组蛋白形式组成。将Nuc-MS应用于多亚基CAP复合物及健康/疾病状态染色质，有望深入揭示表观遗传调控的重要性。当前技术局限包括等重组蛋白形式的区分挑战及样品需求量较大，但随着技术进步，输入要求有望降低。