《ACS Chemical Neuroscience》：Multicolor Quantum Dot Tracking Uncovers Phenotypic Rescue of DAT A559V Aberrant Diffusion Upon D2R Antagonism
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本研究发现D2R（D2 dopamine receptor）拮抗剂Raclopride（RCP）可特异性拯救神经精神疾病相关DAT（dopamine transporter）突变体A559V的异常膜扩散表型，首次在活细胞中报道了DAT-D2S（D2R short isoform）共定位寿命，为理解DAT磷酸化调控膜微域共限制提供了单分子动力学证据。
引言
儿茶酚胺类神经递质多巴胺在调控奖励、情绪和认知等行为中发挥核心作用。多巴胺信号异常与帕金森病、精神分裂症、重度抑郁症、双相情感障碍、自闭症谱系障碍和注意缺陷多动障碍等多种神经精神疾病密切相关。位于突触前膜的Na+/Cl–耦合多巴胺转运体（DAT）通过将突触间隙的多巴胺回收至细胞内，精确调控多巴胺能信号强度。人类DAT基因（DAT1, SLC6A3）的多态性已被证实与注意缺陷多动障碍、双相情感障碍和青少年肌张力障碍相关。除了经典的囊泡胞吐/内吞介导的垂直运输外，DAT通过侧向膜扩散进行水平运输的调控机制日益受到关注。
研究DAT单分子侧向膜扩散需要纳米级荧光探针。量子点（Qdot）作为荧光报告分子已被广泛应用于多种神经递质受体和转运蛋白的示踪研究。量子点具有光稳定性强、发射光谱窄、亮度高等独特光物理特性，使其成为活细胞单分子成像的理想工具。本研究团队开创性地使用拮抗剂偶联量子点实现了活细胞膜表面DAT单分子运动的实时监测。
尤其值得关注的是DAT错义突变体A559V，该突变在双相情感障碍、注意缺陷多动障碍和自闭症谱系障碍患者中发现。尽管A559V突变体保持正常的多巴胺摄取功能，却表现出显著的多巴胺异常外流（anomalous dopamine efflux, ADE）现象。研究发现DAT A559V的细胞内N末端发生高磷酸化，抑制D2多巴胺受体（D2R）和Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）活性可消除HEK-293细胞和急性脑切片中的ADE现象。我们前期工作表明DAT A559V具有增加的膜运动性和降低的聚集倾向性，且模拟磷酸化的N末端（S to D）DAT变体表现出类似A559V的扩散模式，支持N末端高磷酸化是决定DAT膜扩散的关键因素。
D2R存在两种亚型：短亚型（D2S）主要分布于突触前膜作为自身受体与DAT共定位，长亚型（D2L）则位于突触后膜。本研究通过量子点单分子定位显微镜技术，探究了D2S拮抗对DAT及其A559V突变体膜运动性的影响，并首次在活细胞中实现了DAT-D2S双色共定位追踪。
结果
D2R抑制引发DAT A559V膜扩散表型拯救
为监测D2R信号对异常DAT A559V侧向运输的影响，研究采用DAT特异性配体IDT444的标记策略。该标记体系包含碳甲氧基-氟苯可卡因类似物、11碳烷基间隔基、聚乙二醇和生物素手柄，可通过亲和素偶联量子点（SAv-Qdot）实现特异性标记。A559V突变位于跨膜结构域12（transmembrane domain 12）。
在转染DAT或DAT A559V的HEK-293细胞中，预先加入选择性D2R抑制剂雷氯必利（Raclopride, RCP; 1 μM）处理20分钟后，通过高速转盘共聚焦显微镜以10赫兹频率进行SAv-Qdot-DAT成像。代表性轨迹重建显示，量子点光稳定性使单个DAT池在焦平面持续存在达600帧（100毫秒曝光时间）。
平均跳跃距离（mean jump distances, MJD）分析显示所有条件下峰值均集中在80纳米左右，与已报道DAT MJD范围一致。但由于瞬时运动参数如MJD不能准确描述时间依赖性扩散动力学，研究进一步计算了平均均方位移（mean square displacement, MSD）。基础条件下DAT和DAT A559V均显示受限运动，且A559V斜率大于野生型，与前期报道一致。值得注意的是，DAT A559V + RCP的MSD斜率与DAT和DAT + RCP极为相似。
扩散系数（DMLE）累积概率分布显示，D2R抑制显著降低了DAT A559V的扩散速率，而对野生型DAT无影响。箱式图进一步验证了这一趋势。此外，5秒径向位移矢量分析表明，D2R抑制对野生型DAT位移无影响，但使DAT A559V位移显著降低至与野生型DAT相当的水平。
异常DAT A559V膜扩散对CaMKII N末端活性不敏感
为探究与ADE相关的D2R介导CaMKII活性是否与异常DAT A559V侧向运输偶联，研究评估了通用CaMKII抑制剂KN93的作用。在共表达DAT A559V与GFP标记的CaMKII野生型或失活变体（K42R）的HEK-293细胞中，预先用5 μM KN93或失活类似物KN92处理20分钟。结果显示，CaMKII抑制对DAT A559V的MSD、扩散速率或5秒位移均无显著影响。抑制HEK-293细胞内源性CaMKII活性也得到相似阴性结果。
同步双色量子点成像揭示DAT与D2S高时空分辨率相互作用
为表征DAT与D2S的动态行为，研究建立了同时监测活细胞膜表面DAT和D2S的双色标记体系。DAT采用前述拮抗剂标记策略，D2S则采用针对其胞外N末端（氨基酸11-26）的一抗/二抗量子点705（Ab-Qdot 705）标记方案。为最大化观测瞬时相互作用概率，实验共转染DAT/DAT A559V与未标记D2S至HEK-293细胞。
通过双色全内反射荧光（TIRF）显微镜以58赫兹频率成像，在17毫秒曝光时间下观察到SAv-Qdot 605（DAT）与Ab-Qdot 705（D2S）的清晰光谱分离（估计光谱重叠3%）和高信噪比点扩散函数。采用TrackMate进行轨迹生成，并利用ExTrack算法进行扩散状态概率注释和位置优化。通过双态注释模型，将显示扩散运动的点注释为高扩散状态概率（Diff.; state 1），显示束缚运动的点注释为高固定状态概率（Im.; state 0）。
研究将DAT-D2S相互作用定义为衍射极限共定位-共扩散事件。当表面DAT/DAT A559V与D2S共定位距离小于1像素（0.117微米）时，追踪这些瞬时事件并从中分离出共定位轨迹。
D2S运动性对RCP抑制不敏感
双态模型分析显示，RCP处理使DAT A559V扩散速度（D1）衰减而野生型DAT不敏感的趋势得以重现。值得注意的是，D2S的D1不受RCP处理影响，且与共表达的转运蛋白类型无关。固定状态扩散系数（D0）无显著变化，该群体被解释为固定DAT/D2S与玻片粘附量子点的混合群体。对玻片粘附SAv-Qdot 605的双态分析显示D0和D1值与前期固定量子点报道一致。
有趣的是，移动状态粒子比例（F1）在两种转运蛋白和D2S中均保持不变，特别是在RCP处理下DAT A559V扩散速度降低的情况下。所有D1和D0扩散系数值均显著大于单色量子点-DAT追踪结果，可能是视频采集采样率差异所致。
RCP抑制增加D2S与DAT和DAT A559V共定位寿命但不影响事件总数
共定位事件分析显示，RCP处理对DAT或DAT A559V的平均共定位事件数无显著影响。然而，RCP抑制显著增加了两种DAT与D2S的平均共定位寿命，并降低了估计解离速率（koff）。基础条件下DAT-D2S（51 ± 0.7毫秒和25 ± 0.4秒–1）与DAT A559V-D2S（53 ± 0.8毫秒和26 ± 0.4秒–1）的平均寿命和koff相同。RCP抑制下，DAT-D2S（60 ± 1毫秒和21 ± 0.3秒–1）和DAT A559V-D2S（60 ± 0.9毫秒和24 ± 1秒–1）的寿命和koff均发生显著变化。这些发现是首次报道的DAT-D2S共定位寿命，与NMDA-D1受体和D2R二聚体的报道值相当。
DAT扩散状态概率在共定位期间下降而不影响D2S
针对共定位轨迹的扩散状态概率分析显示，基础条件下转运蛋白和受体在共定位轨迹中的概率中位数均保持在0.7以上。然而在RCP抑制下，仅DAT和DAT A559V在共定位期间概率降至0.7以下，而D2S无变化。特别值得注意的是，DAT A559V在共定位期间的状态概率降至0.5。
讨论
本研究通过动态成像揭示了D2R拮抗作用下DAT A559V侧向扩散速率的表型拯救现象。虽然HEK-293细胞内源性表达D2R，但其具体亚型尚未明确。D2R激活通过触发细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、蛋白激酶Cβ（PKCβ）和CaMKII等细胞内信号通路，调控DAT磷酸化、内吞、外流和循环过程。这些信号事件可改变DAT表面表达，从而调节多巴胺再摄取效率和突触水平。
前期研究发现PKCβ介导的DAT A559V扩散调控，为N末端磷酸化与DAT运动性之间建立了关键联系。本研究则表明DAT A559V膜运动性对CaMKII介导的调控不敏感。基础条件下DAT磷酸化程度最低，而药理学表征显示DAT A559V N末端在1-15位氨基酸的丝氨酸残基发生高磷酸化。此状态下DAT A559V对苯丙胺（AMPH）诱导的垂直运输具有抵抗性，且经历ADE现象。
共免疫沉淀研究证实DAT N末端（氨基酸1-15）与D2R（包括D2S和D2L）胞内第三环（ICL3; 氨基酸311-344）存在物理相互作用，提示DAT/D2R可能形成功能性DAT单元。本研究通过同步双色成像挑战了这一观点，发现基础条件下DAT与D2S可能不形成稳定二聚体，共定位-共扩散事件更可能反映微域共限制而非直接物理相互作用。
这一解释得到全局扩散参数支持：虽然DAT A559V运动性重现前期发现，但D2S运动性不受转运蛋白类型或直接拮抗影响。特别值得注意的是，RCP抑制下共定位寿命增加并未伴随D2S扩散速度（D1）降低，进一步支持稳定二聚化缺失。D2S可能存在于特定膜微域中，DAT瞬时进入这些域而不形成直接物理相互作用。
膜表面存在两种构象DAT池：面向胞质的内向构象易聚集形成纳米域，而面向胞质的外向构象聚集倾向较低。D2R激活通过促进DAT聚集使平衡移向运动性较低的内向构象，而抑制则降低表面DAT水平使平衡移向运动性较高的外向构象。本研究的DAT标记策略选择性靶向外向构象，解释了为何未观察到D2R阻断对DAT运动性的影响。
研究结果揭示了DAT与D2S之间的动态相互作用，最重要的是证明D2S抑制可拯救DAT A559V异常运动性。量子点探针的最大化时空分辨率应用，首次在活细胞中记录了DAT-D2S共定位寿命。未来研究需要区分内向与外向构象DAT群体的运动特征及其与D2S相互作用模式，并深入探索DAT A559V与膜脂质如胆固醇和/或PIP2的共定位程度。这些数据为理解蛋白质相互作用如何影响DAT生物物理特性提供新视角，可能为替代或补充经典多巴胺信号靶向药物提供新策略。
材料与方法
实验采用链霉亲和素量子点655（SAv-Qdot 655）、605（SAv-Qdot 605）和F(ab′)-羊抗兔IgG二抗量子点705（Ab-Qdot 705）。兔抗D2R（胞外）抗体购自Alomone公司。细胞培养采用DMEM培养基添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。HEK-293细胞接种于多聚赖氨酸包被的培养皿，通过Lipofectamine 3000转染相应质粒DNA。
单色量子点标记采用两步法：细胞与IDT444共孵育10分钟后，与5 pM量子点-2%透析BSA溶液反应。双色标记则在阻断缓冲液中进行，先后加入抗D2S抗体、RCP和IDT444，最后与SAv-Qdot 605和Ab-Qdot 705共孵育。
显微镜成像采用尼康Ti-Eclipse倒置显微镜系统（转盘共聚焦）和ONI Nanoimager系统（TIRF）。单粒子追踪通过ImageJ的TrackMate插件实现，采用ExTrack算法进行扩散状态概率注释。统计比较采用GraphPad Prism软件，所有结果均来自至少三次生物学重复和技术重复。
