《ACS Nano》：Prototyping Minimal Extracellular Vesicle Mimetics Using Cell-Free Synthesis
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本综述系统介绍了VESSEL（Vesicle Engineering Systems using Synthetic Expression and Loading）平台的构建与应用，该平台通过无细胞蛋白合成（CFPS）技术将39种细胞外囊泡（EV）表面蛋白结构域锚定在人工纳米囊泡（ANVs）上，成功创建了尺寸均一（50-150 nm）、蛋白组成明确的EV仿生体。研究采用单囊泡流式细胞术、超分辨成像等高精度检测手段，首次揭示了CADM1、NPTN等新型蛋白在介导HEK293FT细胞摄取中的关键作用，并验证了CD166等蛋白在SH-SY5Y神经保护模型中的功能。该工作为解析EV表面蛋白的独立功能提供了高通量研究范式，对精准设计EV类 therapeutics 具有重要指导意义。
引言部分指出，细胞外囊泡（EVs）表面蛋白的异质性严重阻碍了其功能机制的精准解析。传统基因敲除或抗体阻断方法难以区分单一蛋白的贡献，而重组蛋白修饰的合成囊泡又面临成本高、规模受限的挑战。本研究旨在开发一种模块化平台VESSEL，通过无细胞蛋白合成（CFPS）技术快速构建表面蛋白组成明确的人工纳米囊泡（ANVs），以系统性研究EV表面蛋白的独立功能。
结果部分首先展示了VESSEL平台的核心技术路线。研究人员通过超声法制备了尺寸与天然EVs相近（50-150 nm）的DOPC/POPC脂质体，并利用纳米颗粒追踪分析（NTA）、冷冻电镜等技术验证了其形态均一性。随后，通过优化的大肠杆菌无细胞表达系统，将选自胎盘间充质干细胞（PMSCs）EVs蛋白组学的39种单次跨膜蛋白胞外域与锚定蛋白Aquaporin-Z（AQP-Z）融合表达。与Transferrin锚定和Strep-tag化学偶联方法相比，AQP-Z展现出更稳定的共翻译插入效率，蛋白质显示量达11 μg/mL，约50%的囊泡表面可检测到目标蛋白。
在功能验证环节，研究团队通过单囊泡流式细胞术和细胞摄取实验发现，不同蛋白-ANVs在HEK293FT细胞中的摄取效率存在显著差异。其中LAMP1-ANV、CADM1-ANV、NPTN-ANV等5种蛋白被归类为“强效摄取型”，其摄取率在80%以上且受剂量影响较小；而CD9-ANV等7种蛋白则无显著摄取促进作用。值得注意的是，降低质粒浓度可线性调控蛋白显示密度，并直接影响囊泡摄取效率，证实了平台的可调控性。进一步分析表明，蛋白摄取功能与其净电荷、分子量无显著相关性，提示特异性蛋白-细胞相互作用是主要机制。
在神经保护功能研究中，CD166-ANV、PDPN-ANV和AMGO2-ANV能显著促进经斯塔孢霉素损伤的SH-SY5Y细胞神经突生长，而可溶性蛋白GAL-1-ANV和HGF-ANV未显现预期效果。跨细胞系比较发现，在HEK293FT中高效的CADM1-ANV在SH-SY5Y细胞中摄取率显著降低，凸显了蛋白功能的细胞类型特异性。
结论部分强调，VESSEL平台通过“自下而上”策略成功实现了EV表面蛋白功能的独立解析，发现了CADM1、NPTN等新型功能蛋白，为EV治疗剂的设计提供了新靶点。平台当前局限性在于主要适用于单次跨膜蛋白，且大肠杆菌CFPS系统缺乏真核翻译后修饰。未来可通过整合哺乳动物无细胞系统或多蛋白组合表达进一步拓展应用边界。
研究方法详述了脂质体制备、无细胞提取物制备、金门组装 plasmid 构建等关键技术环节。囊泡纯化采用35 nm尺寸排阻色谱（SEC）联合100 kDa Amicon超滤离心策略，功能检测则结合了Western blot、ELISA、超分辨显微镜（ONI Nanoimager）等多维验证手段。细胞实验均设置严格的对照，并通过钙黄绿素-AM（Calcein-AM）染色骨架化算法量化神经突生长，确保数据可靠性。
