陆生蝾螈体内脱氧及差向异构河豚毒素类似物的鉴定揭示陆相河豚毒素生物合成中的逐步氧化机制

《Journal of Natural Products》：Identification of Deoxy- and epi-Tetrodotoxin Analogues from the Newt Cynops ensicauda popei Suggests Stepwise Oxidation in Terrestrial Tetrodotoxin Biosynthesis

本研究通过高分辨率质谱与核磁共振技术，首次从日本剑尾蝾螈（Cynops ensicauda popei）中鉴定出五种新型脱氧及差向异构河豚毒素（TTX）类似物，包括6-差向-11-脱氧TTX、8-差向-6-脱氧TTX等。研究揭示了陆生TTX生物合成中存在C-6与C-11位点的逐步氧化路径，其氧化逻辑与海洋生物相似，但具体类似物组成存在显著差异（如陆生特有6-差向/8-差向构型及10-半缩酮型类似物）。细胞实验证实6-差向-11-脱氧TTX仍保留钠通道（Nav）抑制活性，为TTX构效关系研究提供新依据。该成果为解析TTX在陆生环境中的生物合成途径提供了关键线索。

　　

Detection and Purification of Deoxy-Type TTX Analogues in Cynops ensicauda popei

研究团队对127只日本剑尾蝾螈（Cynops ensicauda popei）的皮肤及体组织提取物进行高分辨率亲水相互作用色谱-质谱（HR-HILIC-LCMS）分析。通过精确质量筛查，在蝾螈提取物中未检测到海洋生物中常见的脱氧型TTX类似物（如5,6,11-三脱氧TTX、5,11-双脱氧TTX等），但明确检测到11-脱氧TTX（10）及四个未知峰（化合物2–5）。采用反相C18、活性炭、弱阳离子交换、水型C18及HILIC色谱联用技术对目标成分进行分离纯化。各纯化化合物的高分辨质谱均显示质子化分子[M+H]⁺信号，化合物2–4的分子式为C₁₁H₁₇N₃O₇（较TTX少一个氧原子），化合物5的分子式为C₁₁H₁₅N₃O₅（较TTX少三个氧原子和两个氢原子）。纯化样品通过核磁共振（NMR）技术进行结构解析。

Structure Elucidation of 6-epi-11-deoxyTTX (2)

化合物2的¹H NMR谱显示半缩醛形式（2a）与10,7-内酯形式（2b）共存（比例11:9）。通过二维NMR分析（COSY、TOCSY、HSQC、HMBC、NOESY）归属了所有质子与碳信号（除可交换质子及C-2碳信号）。关键HMBC相关信号（如H₃-11/C-6、H-7/C-8a）及屏蔽的甲基质子信号（δ_H1.28）表明其为11-脱氧衍生物。与已知11-脱氧TTX（10）的NMR数据对比，H₃-11化学位移向高场移动0.36 ppm，提示C-11甲基处于轴向位置，证实为C-6差向异构体（6-差向构型）。NOESY谱中观察到H₃-11与H-8、H-4a间的核奥弗豪泽效应（NOE），进一步验证6-差向构型。其他手性中心相对构型与TTX一致，故鉴定为6-差向-11-脱氧TTX。该化合物在蝾螈体内含量较低，为其作为生物合成中间体提供佐证。

Structure Elucidation of 8-epi-6-deoxyTTX (3)

化合物3与已知TTX类似物6-差向-4,9-脱水TTX（18）以1:1比例共存于¹H NMR谱中。其半缩醛形式（3a）的NMR数据显示羟甲基质子H₂-11（δ_H3.90, 3.98）及与H₂-11耦合的次甲基质子H-6（δ_H2.02），表明为6-脱氧结构。与6-脱氧TTX（17）对比，H-4a、H-6、H-8化学位移分别向低场移动0.24 ppm、0.16 ppm、0.15 ppm，提示C-8羟基为轴向取向（8-差向构型）。NOESY谱中H-8与H-9间的NOE信号（而H-8与H-4a/H-6间无NOE）证实8-差向构型，C-6构型与TTX相同。该化合物为首个8-差向型单脱氧类似物。

Structure Elucidation and Chemical Verification of 1-hydroxy-8-epi-6,11-dideoxyTTX (4) and Identification of Natural Analogue 8-epi-6,11-dideoxyTTX (6)

化合物4的¹H NMR谱显示半缩醛形式（4a）与10,7-内酯形式（4b）共存（比例4:1）。屏蔽的H₃-11甲基信号（δ_H1.27）及H-6信号（δ_H2.00）表明其为6,11-双脱氧结构。分子式较TTX少一个氧原子，提示存在其他位点氧化。与非质子化碳C-8a显著去屏蔽（+7.2 ppm）及H-4a、H-6、H-8去屏蔽现象结合，推断其含1-氮羟基（N-OH）且为8-差向构型。NOESY谱中H-8与H-9间NOE（无H-8与H-4a/H-6间NOE）支持8-差向构型，故鉴定为1-羟基-8-差向-6,11-双脱氧TTX。

为验证N-OH基团，化合物4经锌-乙酸还原反应后，HILIC-LCMS分析显示新峰（m/z 288.1205），对应8-差向-6,11-双脱氧TTX（6）。重新分析蝾螈提取物发现天然存在的6，其保留时间、精确质量及MS/MS谱与还原产物一致，证实6为新型天然TTX类似物。

Structure Elucidation and Chemical Verification of 1-hydroxy-4,9-anhydro-8-epi-10-hemiketal-5,6,11-trideoxyTTX (5)

化合物5的NMR谱呈现单一信号组。屏蔽的H₃-11甲基信号（δ_H1.09）及H-6信号表明为6,11-双脱氧结构。分子式提示4,9-脱水特征，H-4与H-4a单峰信号进一步支持该推断。H-5（δ_H2.10）与C-5（δ_C49.4）化学位移符合5-脱氧特性，C-10共振信号（δ_C107.1）及HMBC相关（H-6/C-10、H-4a/C-10）表明存在10-半缩酮-5-脱氧结构。与已知类似物19对比，C-8a显著去屏蔽（+6.3 ppm）提示含N-OH基团。NOESY谱中H-8与H-9间NOE确认8-差向构型，故鉴定为1-羟基-4,9-脱水-8-差向-10-半缩酮-5,6,11-三脱氧TTX。锌-乙酸还原反应将其转化为已知化合物19，验证了结构。

Biosynthetic Implications of the Identified Deoxy- and epi-Tetrodotoxin Analogues

本研究共鉴定五种TTX类似物（2–6），其结构特征揭示了陆生TTX生物合成路径的氧化逻辑。基于前期提出的萜类胍啶前体（如香叶基胍啶）经双环胍啶中间体（如Cep-210）形成三环中间体（21），再转化为4,9-脱水-10-半缩酮-5-脱氧TTX（11）的框架，新发现的类似物进一步明确了C-6与C-11位点的逐步氧化序列。6-差向-11-脱氧TTX（2）是6-差向TTX（7）的前体；8-差向-6,11-双脱氧TTX（6）可经C-11氧化生成8-差向-6-脱氧TTX（3），再经C-6氧化生成8-差向TTX（8）。化合物5作为10-半缩酮型三脱氧类似物，可能通过Baeyer-Villiger氧化插入氧原子生成化合物4，后者进一步氧化可产生1-羟基-8-差向TTX（9）。所有N-OH类似物在粗提物阶段即被检测，且未在河豚样本中发现，证实其陆生特异性。这些类似物相对丰度较低（0.23–4.1%），符合生物合成中间体特征。陆生与海洋TTX类似物组成差异（如陆生特有6-差向/8-差向构型及10-半缩酮型）反映了生物合成路径的分化。

Na_vInhibitory Activity of 6-epi-11-deoxyTTX (2)

采用Neuro-2a细胞模型评估6-差向-11-脱氧TTX（2）的钠通道（Na_v）抑制活性。细胞在藜芦定与乌本苷诱导下死亡，TTX类似物通过阻断Na_v提升细胞存活率。TTX的EC₅₀值为6.4 ± 1.5 nM，化合物2的EC₅₀为187 ± 50 nM，活性较TTX降低29倍。前期研究表明，6-脱氧TTX（17）、11-脱氧TTX（10）和6,11-双脱氧TTX（15）的活性分别降低3倍、62倍和190倍，提示C-6位 equatorial CH₂OH对活性贡献大于轴向羟基。6-差向TTX（7）活性降低17倍，与化合物2活性相近，表明C-6位轴向取代基由CH₂OH变为CH₃对活性影响较小。该结果细化了对TTX C-6区域构效关系的认知。

Experimental Section

核磁共振实验使用Bruker AVANCE III 600谱仪，溶剂为CD₃COOD/D₂O（4:96）。高分辨质谱采用micrOTOF-QII质谱仪，电离源为ESI。色谱纯化联合反相C18、活性炭、弱阳离子交换柱及HILIC柱进行。活性测定通过Neuro-2a细胞模型，以WST-8法检测细胞活力，剂量反应曲线拟合计算EC₅₀值。