药物重定位新策略：HIV蛋白酶抑制剂安普那韦转化为高效选择性中枢神经系统渗透性大麻素受体2激动剂

《Journal of Medicinal Chemistry》：Drug Repurposing: Conversion of the Peripherally Restricted HIV Protease Inhibitor Amprenavir to Potent, Selective, and CNS-Penetrant Agonists for the Cannabinoid Receptor 2

本文系统阐述了将外周限制性HIV蛋白酶抑制剂安普那韦（Amprenavir）成功改造为高效力、高选择性且具有中枢神经系统（CNS）渗透性的大麻素受体2（CB2）激动剂的创新研究。通过结构-活性关系（SAR）优化，获得了EC50值低于10 nM的强效CB2激动剂，并证实其对CB1无显著活性。研究结合分子动力学（MD）模拟揭示了VU6077967与CB2的相互作用模式，为靶向CB2的神经退行性疾病及精神疾病治疗提供了新思路。

引言

大麻素受体1（CB₁）作为大麻植物源性大麻素精神活性的主要驱动因子，引发了对内源性大麻素（EC）系统成药性的广泛关注。CB₁和CB₂是G蛋白偶联受体（GPCR），主要与G_i/o蛋白偶联，其激活会导致腺苷酸环化酶活性降低、环磷酸腺苷（cAMP）产生减少和离子通道调节。CB₁在中枢神经系统（CNS）中高表达，而CB₂传统上被认为主要在外周组织中表达。然而，随着蛋白质检测技术的进步，发现CB₂在包括海马体、大脑皮层、纹状体、嗅球和脊髓核、杏仁核、丘脑和小脑在内的多种脑区也有分布，尽管其丰度相对于CB₁较低。这种广泛的CNS分布促使了大量令人兴奋的研究，阐明了该受体在多种CNS相关适应症中的作用，包括阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、多发性硬化症和情绪障碍等。

尽管结构多样化的CB₂调节剂已进入临床开发阶段，但迄今为止尚无CB₂选择性化合物上市。这种缺乏成功的情况表明需要具有改进的靶点结合、更优的物理化学性质和/或相对于CB₁更高选择性的CB₂配体。CB₂的药物开发进一步受到受体信号传导和分子药理学复杂性的困扰。虽然CB₂是经典的G_i/o偶联受体，但也观察到G_αq和G_αs偶联的情况。此外，在不同的CB₂化学型和临床前物种中观察到了功能选择性（信号偏倚）的差异。计算研究表明，CB₂可能拥有多达七个可成药的结合口袋，这对临床前检测中的探针依赖性和功能选择性提出了重要问题。显然，对新旧CB₂化学型进行详细的药理学表征存在未满足的需求。

结果与讨论

本研究通过筛选一个小型（约1000种化合物）FDA批准药物库，使用铊流功能性检测作为更大规模高通量筛选（HTS）的试点，旨在鉴定新型CB₂化学物质。除了鉴定出免疫抑制剂霉酚酸酯（mycophenolate mofetil）作为一种有效和选择性的CB₂激活剂外，该筛选还鉴定出HIV蛋白酶抑制剂安普那韦（Amprenavir）为CB₂激活剂（在大鼠CB₂/GIRK细胞铊流检测中的EC₅₀= 760 nM，最大效应49%）。受这一不寻常发现以及将抗病毒化合物重新用于中枢神经系统GPCR前景的启发，研究团队着手了解安普那韦支架对CB₂活性的结构-活性关系（SAR）要求。

在SAR研究开始时，研究团队意识到与此项工作相关的若干挑战，即为此类化学型获得合理的中枢神经系统暴露的困难（安普那韦是一个大的、极性分子，并且是已知的P-糖蛋白（P-gp）介导的外排底物）。尽管如此，研究团队设计初始类似物的目标是改善安普那韦化学型的中枢神经系统渗透性。

研究首先证实了安普那韦通过CB₂发挥其活性，在表达GIRK通道但不表达CB₂的HEK细胞中测试发现其无活性，表明其活性是CB₂依赖性的。研究还确定了亚型选择性，在表达rCB₁和GIRK通道的细胞中测试安普那韦活性，发现它没有增强反应，反而抑制了反应。由于铊流检测通常在存在亚最大浓度2-AG的情况下进行以允许检测增强剂，因此在没有2-AG的情况下确定安普那韦的活性也很重要。在这种情况下，发现安普那韦的效力相当（EC₅₀= 969 nM，最大效应55%），与在存在2-AG的情况下确定的效力一致，符合激动剂活性而非增强剂活性。研究在通过嵌合G蛋白偶联的正交磷脂酰肌醇（PI）水解检测中证实了激动剂活性（EC₅₀= 690 nM）。接下来，研究检查了安普那韦在人和大鼠微粒体中的预测清除率，以及在转染了MDCKII-MDR1细胞中预测的人P-gp外排，以了解其药代动力学（PK）特性。发现安普那韦在两种物种的微粒体中具有高的预测肝清除率，并被再次确认为P-gp外排的底物（外排比 = 44；表观渗透系数A到B（P_appA-B） = 6.1 × 10^–6cm/s）。因此，确定了支架改进的三个主要领域：（1）提高CB₂激动剂效力；（2）改善跨物种（人/大鼠）的预测微粒体清除率；（3）减少预测的P-gp外排。

推测安普那韦中的苯胺基序至少部分导致了观察到的有限的脑暴露，研究首先合成了安普那韦的直接去氨基（des-NH₂）类似物，化合物11a。令人鼓舞的是，直接去苯胺类似物11a被发现在没有2-AG的情况下相对于安普那韦具有改善的激动剂效力（CB₂EC₅₀分别为306 nM和969 nM），并且在P-gp外排方面有显著改善（外排比 = 3.6；P_appA-B= 46 × 10^–6cm/s）。研究团队进一步满意地发现，相反的对映体呋喃（（R）-呋喃基类似物11b）在效力方面显示出更大的改进（74 nM，相对于11a效力提高约4倍），同时具有低的预测P-gp外排活性和高的被动渗透性（外排比 = 2.4；P_appA-B= 56 × 10^–6cm/s）。

了解到5的苯胺基序在效力和外排方面是有害的之后，研究团队接下来将注意力转向了在未取代的苯磺酰胺背景下对南部氨基甲酸酯侧链进行调查（类似物11c–j）。发现手性3-吡喃基化合物11c和11d比3-呋喃基对应物（11a和11b）更有效，并且在对映体偏好方面遵循类似的趋势。实际上，（R）-吡喃基类似物11d比（S）-吡喃基类似物11c有效约4倍，并且是该系列中迄今为止合成的最有效的类似物（CB₂EC₅₀= 8.6 nM）。有趣的是，4-吡喃基类似物11e和环丁基类似物11g没有激活受体，反而诱导反应降低。环丙基类似物11f的效力也降低了。相反，研究团队受到鼓舞地发现，当从氨基甲酸酯侧链切换到酰胺时，额外的脂肪族基团耐受性良好，包括双环[1.1.1]戊烷11h、环丙烷-1-甲酰胺11i和环丁烷-1-甲酰胺11j。总的来说，在酰胺系列中，羰基相邻的季碳的存在耐受性良好，并且倾向于产生高效力的类似物。功效值范围从36%到130%的2-AG最大效应，并继续表现出部分到完全激动剂活性。

鉴于（R）-吡喃基类似物11d的卓越效力，研究团队接下来保持这个南部氨基甲酸酯侧链不变，同时调查磺酰胺的变化。在这种情况下，各种磺酰胺耐受性良好，包括对对位的几种修饰（14a–c），以及各种杂芳烃（14e–h）。虽然总的来说磺酰胺的多样性耐受性良好，但也注意到一些例外：（1）脂肪族磺酰胺的效力明显较低（见环丙基类似物14d），（2）对邻位的修饰通常是有害的（见噻唑类似物14i）。废除活性的磺酰胺基序的其他修饰是（1）用酰胺或胺替换，和（2）亲核手性仲羟基环化得到2-取代的3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4,5]氧杂硫氮杂?1,1-二氧化物系统。

不幸的是，尽管大多数类似物的P-gp外排仍然较低，但到目前为止调查的所有化合物都被发现对人和大鼠具有类似高的预测微粒体清除率，这表明需要替代的修饰来解决该支架的代谢热点。

为此，研究团队接下来检查了手性仲羟基的删除；去羟基系列中的最终类似物按照方案3所示制备。总的来说，尽管去羟基系列中的效力相对于前一个系列更陡峭，但某些氨基甲酸酯/酰胺侧链耐受性良好，特别是环丙基氨基甲酸酯类似物21b（CB₂EC₅₀= 146 nM）以及环丁烷-1-甲酰胺21d和新戊酰胺21e（CB₂EC₅₀分别为185 nM和160 nM）。在这种情况下，与21a类似的（R）-吡喃基化合物未被表征；该化合物独特地显示出测定运行之间的可变药理学，特别是后续测试中活性丧失。需要后续研究来确认这种现象是否是特殊不稳定性