《Frontiers in Immunology》：7-Ketocholesterol promotes T cell migration through Ca2+-NFATc1 pathway-mediated F-actin polymerization and proinflammatory cytokine production in oral lichen planus
编辑推荐：
本研究首次揭示口腔扁平苔藓（OLP）患者血浆中7-酮胆固醇（7KC）显著升高，通过激活Ca2+-NFATc1信号通路，促进T细胞F-肌动蛋白（F-actin）聚合和炎症因子（IL1B/CCL4/IL6）表达，从而增强T细胞迁移能力。该发现为OLP的发病机制提供了新的代谢-免疫调控视角，为靶向钙信号通路治疗OLP提供了理论依据。
背景
口腔扁平苔藓（OLP）是一种病因不明的慢性T细胞介导的炎症性疾病。越来越多的证据表明OLP患者胆固醇水平升高，其氧化产物——氧固醇（oxysterols）与T细胞功能失调有关。然而，氧固醇是否参与OLP的发病机制仍有待阐明。
方法
研究人员对OLP患者血浆进行了代谢组学分析以描绘氧固醇谱，并进行了功能富集分析。利用单细胞RNA测序技术来表征从OLP病变组织中分离的组织驻留T细胞的基因表达失调情况。综合使用流式细胞术、免疫荧光和qRT-PCR来量化Ca2+浓度、细胞凋亡、蛋白表达、细胞内信号传导和基因转录水平。通过共培养模型和Transwell迁移实验进行功能验证，以评估OLP T细胞的细胞毒性和迁移能力。
结果
研究发现OLP血浆中的氧固醇谱异常，其中7-酮胆固醇（7KC）显著积累。功能分析发现差异代谢物在雄烯二酮代谢中显著富集。7KC上调了OLP T细胞中胆固醇调节因子（SREBP2/LXR）的表达。促7KC生成的基因集在OLP组织中失调，局部T细胞表现出丰富的Ca2+-NFATc1信号和协调的F-肌动蛋白（F-actin）聚合/ITGAL（LFA-1α）上调，这与迁移特征呈正相关。外周血OLP T细胞显示出升高的Ca2+、核NFATc1、F-actin聚合和LFA-1α，所有这些指标，以及ITGAL/IL1B/CCL4/IL6的水平，在经过7KC处理后均得到进一步增强。研究证实7KC能增强原代OLP T细胞和经OLP血浆预处理的Jurkat T细胞向LPS处理的角质形成细胞的迁移，但不影响角质形成细胞的凋亡。此外，在OLP T细胞中使用CM4620介导的Ca2+-NFATc1通路阻断，抑制了7KC诱导的NFATc1活化，降低了F-actin及其调节因子ACTB/DIAPH1的表达，以及IL1B/CCL4/IL6的基因表达，并抑制了原代OLP T细胞和OLP血浆预处理的Jurkat T细胞的迁移。
结论
7KC可以通过Ca2+-NFATc1通路介导的F-actin聚合和IL1B/CCL4/IL6的表达来促进OLP中T细胞的迁移。
异常固醇与功能
鉴于OLP中失调的胆固醇是所有类固醇代谢物的中心前体分子，其调节自身免疫中的T细胞反应，研究人员旨在确定OLP患者血浆中主要的失调类固醇。OLP患者血浆中7KC的浓度显著高于健康对照，其正相关代谢物7-羟基胆甾烯-3-酮呈上升趋势。相反，正相关的睾酮、雌酮和雄烯二酮的水平呈下降趋势。对OLP中丰度变化的代谢物进行KEGG分类，突出了它们参与类固醇激素生物合成和卵巢类固醇生成。在KEGG通路富集和差异丰度评分分析中未发现达到统计学显著性阈值的通路。HMDB功能富集分析显示，差异代谢物在“雄烯二酮代谢”功能类别中显著富集。HMDB数据库注释将7KC确定为先前与自身免疫性疾病发病机制相关的代谢物。进一步的流式细胞术研究表明，7KC对OLP T细胞中的胆固醇代谢轴SREBP2-LXR产生了反调节作用，显著上调了SREBP2和LXR的表达。
单细胞测序揭示局部OLP T细胞中失调的促7KC生成基因以及与迁移相关的过度活跃的Ca2+-NFATc1-F-actin/LFA-1α信号轴
使用UMAP可视化揭示了来自正常、非糜烂型OLP（NEOLP）和糜烂型OLP（EOLP）样本的细胞簇，被注释为12种主要细胞类型。与正常组织相比，OLP样本中T细胞比例的增加比其他细胞类型更明显，其次是OLP中NK细胞、B细胞和肥大细胞比例升高，NEOLP中上皮细胞比例增加，EOLP中巨噬细胞、内皮细胞、淋巴管内皮细胞、浆细胞和树突状细胞比例更高。跨NEOLP、EOLP和正常组织细胞簇的促7KC生成基因（功能涉及底物生产、酶促合成和氧化应激生成）的UMAP可视化显示，底物生物合成基因和促氧化基因在多个簇中表达，包括T细胞，其中RELA和SQLE的水平尤其增加。然而，促7KC生成基因集的综合评分显示，OLP中大多数细胞的评分低于正常对应细胞，包括T细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、自然杀伤细胞、上皮细胞、淋巴管内皮细胞、浆细胞和树突状细胞。基于7KC在激活Ca2+-NFATc1通路以及下游F-actin/LFA-1α介导的OLP致病作用，进一步探索了局部OLP T细胞中的Ca2+-NFATc1-F-actin/LFA-1α轴。局部OLP T细胞中钙信号通路基因集、F-actin动态基因集、NFATC1表达水平和ITGAL（编码LFA-1α的基因）的评分均显著高于对照组，其中NEOLP中水平最高，表明Ca2+-NFATc1-F-actin/LFA-1α信号轴在局部OLP T细胞中活跃。此外，具有高水平F-actin动态基因集或ITGAL的T细胞显示出迁移相关基因的AddModuleScore显著升高。相比之下，NFATC1-high T细胞显示出降低的迁移相关基因评分。对于钙信号通路或促7KC生成基因集，高表达和低表达T细胞组之间未观察到显著差异。迁移相关基因的小提琴图显示，在F-actin动态基因集-high的T细胞中，趋化因子基因CXCR3、粘附相关基因ITGAL/ITGB2和细胞骨架调节基因RHOA/CDC42上调；在ITGAL-high T细胞中，趋化因子基因CXCR3、粘附相关基因ITGB2/ITGA4/ITGB1和转录激活因子STAT4表达升高；在NFATC1-high T细胞中，趋化因子基因CCR4/CXCR4、粘附相关基因ITGAL/ITGB2和转录激活因子STAT1/STAT4水平增加。GO分析显示，具有高钙信号通路基因集评分的T细胞在“通过电耦合调节细胞通讯”以及钙离子检测、转运调节、跨膜活性调节和下游细胞反应方面显著富集。KEGG分析显示，OLP中钙信号-high的T细胞与多种通路相关，包括“脂质与动脉粥样硬化”、“cAMP信号通路”、“钙信号通路”、“苯丙胺成瘾”、“催产素信号通路”、“醛固酮合成与分泌”、“神经营养蛋白信号通路”、“多巴胺能突触”和“长时程增强”。
外周OLP T细胞中Ca2+-NFATc1-F-actin/LFA-1α信号轴显著激活
为了研究外周OLP T细胞中的Ca2+-NFATc1-F-actin/LFA-1α信号轴，研究人员分离了OLP患者的PBMCs，并纯化了CD3+T细胞。流式细胞术分析显示，与对照组相比，OLP T细胞中细胞内Ca2+和LFA-1α的水平显著升高。对纯化的OLP CD3+T细胞中F-actin进行荧光探针标记，显示F-actin表达和聚合增强，共聚焦显微镜显示更致密和更长的丝状结构，统计学分析证实F-actin显著上调。免疫荧光染色显示NFATc1的亚细胞定位存在差异，在对照T细胞中主要呈胞质分布，而在OLP T细胞中可见明显的核染色，统计学分析证实OLP T细胞中核NFATc1表达较对照组显著增加。
7-酮胆固醇激活OLP T细胞中的Ca2+-NFATc1-F-actin/LFA-1α信号轴
为了阐明7KC对OLP T细胞中Ca2+-NFATc1-F-actin/LFA-1α轴的作用机制，研究人员首先确定了7KC的处理条件（5 μM, 24 h）。使用Fluo-3 AM探针，流式细胞术显示7KC显著增加了原代OLP T细胞中Ca2+结合的Fluo-3 AM的平均荧光强度（MFI），以及Ca2+结合的Fluo-3 AM+原代OLP T细胞的百分比。用OLP血浆处理Jurkat T细胞以模拟OLP外周微环境，7KC也显著升高了OLP血浆处理的Jurkat T细胞中Ca2+结合的Fluo-3 AM的MFI。与原代对照/OLP T细胞和对照血浆处理的Jurkat T细胞孵育7KC后，F-actin的表达和聚合增强。免疫荧光显示，7KC显著增强了原代OLP T细胞中NFATc1的核表达，在原代对照T细胞和对照/OLP血浆处理的Jurkat T细胞中也显示出上调趋势。流式细胞术显示，7KC显著提高了原代OLP T细胞中的LFA-1α水平，但在对照/OLP血浆处理的Jurkat T细胞中显示出下调趋势。
7-酮胆固醇增强OLP T细胞的炎症特征和迁移能力
通过qRT-PCR进一步探讨了7KC对原代OLP T细胞中迁移性和细胞毒性炎症分子的影响，结果显示，经7KC处理后，原代OLP T细胞中IL6、IL1B和ITGAL的mRNA水平，以及原代对照/OLP T细胞中CCL4（编码MIP-1β）的mRNA水平显著升高，而CXCL8、TNFA和GZMB水平保持不变。建立了对照/OLP血浆预处理的Jurkat T细胞与LPS预处理的角质形成细胞（以模拟局部炎症）的间接Transwell共培养模型。对迁移至Transwell共培养系统下室的T细胞进行拍照和计数显示，经7KC孵育的对照/OLP血浆预处理的Jurkat T细胞数量显著增加。流式细胞术显示，7KC处理不影响T细胞对角质形成细胞的细胞毒性作用。
钙通道阻断抑制7KC预处理的OLP T细胞中F-actin和核NFATc1的表达
为了阐明7KC是否依赖于Ca2+-NFATc1信号通路来促进OLP T细胞中LFA-1α和F-actin的表达以及F-actin的组装，研究人员使用了钙通道阻断剂CM4620。流式细胞术确定10 μM CM4620为有效阻断钙通道的最佳浓度。抑制钙通道显著减弱了7KC预处理的原代对照/OLP T细胞和血浆预处理的Jurkat T细胞中F-actin的表达。免疫荧光显示，阻断钙通道消除了7KC预激的原代OLP T细胞和OLP血浆预处理的Jurkat T细胞中的核NFATc1，在原代对照T细胞和对照血浆处理的Jurkat T细胞中也呈下降趋势。虽然钙通道阻断并未显著改变7KC预处理的原代T细胞中LFA-1α的表达，但它矛盾地上调了OLP血浆处理的Jurkat T细胞中的LFA-1α。
钙通道抑制减弱7KC预处理的OLP T细胞中的促炎细胞因子谱、F-actin组装和细胞迁移
qRT-PCR分析显示，钙通路阻断显著抑制了原代OLP T细胞中IL6和IL1B的mRNA水平，原代对照/OLP T细胞中CCL4的mRNA水平，以及原代OLP T细胞中F-actin聚合相关基因ACTB和DIAPH1（编码mDia）的mRNA水平。在与LPS预激的角质形成细胞的Transwell共培养实验中，抑制Ca2+通道显著减少了7KC预处理和OLP血浆条件化的Jurkat T细胞迁移至下室的数量。在Transwell共培养系统中，7KC处理的原代OLP T细胞的迁移增强，但在Ca2+通道阻断后减弱。
讨论
口腔扁平苔藓（OLP）是一种病因不明的慢性T细胞介导的炎症性疾病，好发于女性，越来越多地被认为与代谢异常特征相关，包括血浆胆固醇/低密度脂蛋白（LDL）升高和局部氧化应激。作为胆固醇氧化的下游产物，氧固醇现在被认为是自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮SLE和多发性硬化症MS）中的免疫调节剂，可促进致病性T细胞的迁移和活化。氧化LDL衍生的氧固醇7KC在慢性炎症条件（如银屑病、炎症性肠病IBD和多发性硬化症MS）中上调，与MS的疾病严重程度呈正相关，并加剧银屑病中的炎症细胞浸润和细胞因子分泌。本研究对OLP血浆进行的LC-MS/MS分析揭示了胆固醇代谢物类固醇模式的异常，其中7KC显著升高，同时其代谢前体7-羟基-胆甾-4-烯-3-酮增加。相反，彼此正相关的雄烯二酮、睾酮和雌酮呈下降趋势，这与具有OLP易感性的绝经期女性的内分泌变化特征一致。OLP改变代谢物在“雄烯二酮代谢”中的显著富集表明性激素稳态紊乱，与临床观察到的与激素不稳定期（如绝经期）相关的联系相符。本研究对OLP病变的单细胞转录组分析显示，底物促进基因HMGCR、SQLE、LSS和促氧化基因RELA、DUOX1在多个簇中表达，包括T细胞，其中RELA和SQLE的水平尤其增加，暗示存在有利于局部7KC积累的微环境。然而，各种组织细胞中促7KC生成基因集的评分显示显著下调，表明组织驻留细胞中内源性7KC的生成受到抑制。考虑到OLP病变中已证实的氧化应激条件和升高的血浆胆固醇水平（可能增强外源性7KC的产生），OLP组织中实际的7KC含量需要进一步探索。氧固醇可以激活LXR受体并阻止SREBP2裂解活化进入细胞核。本研究中7KC同时刺激了OLP T细胞中LXR和SREBP2的表达，后一种效应可能归因于ROS诱导的应激通路激活，该通路绕过了正常的固醇调节机制。总的来说，涉及内分泌-免疫紊乱的失调胆固醇代谢物在OLP中表现出来，包括OLP血浆中7KC升高、OLP组织细胞成分中7KC生物合成能力紊乱，以及7KC诱导的OLP T细胞中胆固醇代谢调节轴SREBP2-LXR上调。
7KC触发T细胞中的Ca2+内流，激活钙调磷酸酶，随后激活Ca2+-NFATc1通路。Ca2+-NFATc1信号轴已被证实在类风湿关节炎（RA）和SLE等自身免疫性疾病中异常活跃，与RA的疾病易感性和活动性呈正相关。钙调磷酸酶抑制剂通过减弱T细胞炎症反应和调节免疫细胞相互作用，在包括OLP在内的自身免疫性疾病中显示出良好的疗效。本研究结果证明了局部OLP T细胞中Ca2+-NFATc1通路基因表达上调，外周血OLP T细胞中细胞内Ca2+水平升高和NFATc1核转位。功能富集分析显示，具有激活钙信号的OLP T细胞与多种通路相关，包括“通过电耦合调节细胞通讯”、“脂质与动脉粥样硬化”、“cAMP信号通路”、“苯丙胺成瘾”、“催产素信号通路”、“醛固酮合成与分泌”、“神经营养蛋白信号通路”、“多巴胺能突触”和“长时程增强”。这些发现提示OLP T细胞中Ca2+信号与脂质代谢之间存在潜在联系，并且这些富集的通路先前已被证明可调节T细胞迁移和组织归巢、Th细胞亚群极化、炎症性氧化应激、T细胞记忆形成和神经免疫相互作用，强调了Ca2+-NFATc1轴失调在OLP免疫病理学中的潜在作用。此外，7KC显著上调了原代OLP T细胞和OLP血浆处理的Jurkat T细胞中的Ca2+水平，以及原代OLP T细胞中NFATc1的核表达。综上所述，OLP的外周和组织浸润T细胞均表现出增强的Ca2+-NFATc1通路，该通路被7KC进一步强化，并且这些在具有过度活跃Ca2+-NFATc1信号的OLP T细胞中富集的失调通路可能通过调节与T细胞迁移和促炎功能相关的神经-内分泌-免疫相互作用参与OLP的发病机制。
7KC促进炎症细胞因子（如MIP-1β、TNF-α、IL-8、IL-1β、IL-6）和粘附分子LFA-1α的表达，以及F-actin细胞骨架重塑已被证实。F-actin聚合正向调节LFA-1α表达。本研究显示，外周血OLP T细胞表现出增强的F-actin聚合和LFA-1α表达，同时浸润T细胞的转录谱显示富集的F-actin动态相关基因集和升高的ITGAL。此外，具有高表达F-actin动态相关基因集和ITGAL的OLP T细胞显示出诱导的迁移特征，如趋化因子基因、粘附分子基因和细胞骨架调节基因，揭示了F-actin和LFA-1α水平与OLP T细胞迁移和趋化能力增强之间的潜在机制联系。我们的研究结果进一步证明，7KC选择性刺激了迁移相关基因CCL4/IL1B和炎症介质基因IL6，同时增强了原代OLP T细胞中用于粘附的LFA-1α和F-actin聚合，但不影响细胞毒性效应基因TNFA（编码TNF-α）或GZMB（编码颗粒酶B）。Jurkat T细胞中LFA-1α的抑制趋势与该细胞系为增强持续生长而牺牲LFA-1α水平的已证实倾向一致，而持续生长可能被7KC刺激。此外，当与LPS预处理的角质形成细胞共培养时，7KC促进了原代OLP T细胞和OLP血浆预处理的Jurkat T细胞的Transwell迁移，但未能调节角质形成细胞的凋亡，表明7KC在OLP中选择性调节迁移功能而非细胞毒性功能。以上结果表明，7KC可能通过协调上调CCL4/IL1B基因、F-actin聚合和LFA-1α表达来促进T细胞迁移。
Ca2+内流被证实可驱动F-actin聚合，而阻断关键免疫细胞钙通道CRAC可抑制LFA-1活化和跨内皮迁移。Ca2+-NFAT通路也可以调节促炎细胞因子，如TNF-α、MIP-1β和IL-6。本研究表明，阻断CRAC通道显著抑制了7KC处理后原代OLP T细胞和OLP血浆处理的Jurkat T细胞中NFATc1的核表达。此外，它还下调了F-actin的表达和聚合，以及核心F-actin组分ACTB和促聚合分子相关基因DIAPH1在对照/OLP原代T细胞和对照/OLP血浆处理的Jurkat T细胞中的mRNA水平。而且，抑制CRAC通道降低了CCL4、IL6和IL1B
