《Frontiers in Physiology》：Proinflammatory cytokines modify Ca2+ signaling and induce an apoptotic lipidome in murine small intestinal organoids
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本文聚焦炎症性肠病核心病理机制，研究发现促炎因子TNFα/IL-1β/IFN-γ可诱导小肠类器官管腔肿胀，其机制涉及Na+-K+-2Cl-共转运体（NKCC）介导的Cl-分泌及钙信号通路（IP3R1/STIM2）的时相性增强，并同时通过上调神经酰胺、鞘磷脂等“凋亡脂质组”诱导细胞程序性死亡，为深入解析IBD上皮屏障功能障碍提供了新的实验依据。
在炎症性肠病的病理进程中，促炎细胞因子扮演着关键角色。为深入探究其如何影响肠道上皮功能，本研究利用小鼠小肠类器官模型，系统分析了肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1β和干扰素-γ这三种核心促炎因子组合的长期效应。研究聚焦于这些细胞因子对上皮分泌功能、钙离子信号传导、细胞凋亡及上皮细胞脂质组成的影响。
促炎因子组合诱导类器官形态改变与管腔肿胀
显微观察显示，经细胞因子组合处理24小时后，小肠类器官形态发生显著变化，表现为类器官变圆、隐窝与绒毛结构分界模糊，并伴随明显的管腔肿胀。通过对相对管腔大小的动态监测发现，这种肿胀在细胞因子处理约1小时后启动，并在12小时内基本完成，最终管腔面积可达类器官总面积的40%。这种形态学改变提示上皮分泌功能可能被激活。
管腔肿胀涉及氯离子分泌
进一步机制探究表明，布美他尼（一种Na+-K+-2Cl–共转运体NKCC抑制剂）能够显著抑制细胞因子诱导的肿胀，而环氧合酶抑制剂吲哚美辛则无此作用。这提示促炎因子诱导的肿胀与NKCC介导的氯离子分泌途径有关，而非前列腺素依赖的通路。定量聚合酶链反应结果显示，NKCC1和囊性纤维化跨膜电导调节子CFTR的基因表达虽有上升趋势，但未达统计学显著性，暗示肿胀的早期发生可能并非源于基因转录水平的改变。
钙信号传导的时相性调控
钙成像实验揭示了细胞因子处理对卡巴胆碱诱导的钙信号具有复杂且时间依赖性的调节作用。在细胞外液含钙条件下，短期（1天）细胞因子处理显著增强了卡巴胆碱引起的胞浆钙离子浓度升高，表现为Fura-2比值的峰值增大约50%。这一增强效应在细胞外无钙条件或被非选择性阳离子通道阻断剂镧离子抑制后消失，表明其源于胞外钙离子的内流，即电容性钙内流的增强。然而，随着处理时间延长（≥3天），这种对钙内流的增强效应逐渐减弱。相反，在无钙条件下（反映胞内钙库释放），短期细胞因子处理反而抑制了卡巴胆碱的钙响应，而长期处理则增强了该响应。这些结果共同揭示了促炎因子对钙信号通路的双向、时相性调控。
钙信号相关分子表达变化
基因表达分析为上述功能变化提供了部分分子解释。经细胞因子处理3天后，肌醇1,4,5-三磷酸受体1型和基质相互作用分子2的mRNA水平显著上调，这与观察到的电容性钙内流增强趋势一致。然而，位于信号通路上游的毒蕈碱受体M3、Gqα蛋白亚基和磷脂酶Cβ3的基因表达却出现下调，这或许能解释长期处理后钙信号增强效应的减弱。
促炎因子诱导上皮细胞凋亡
肿瘤坏死因子α是已知的细胞凋亡强诱导剂。免疫荧光染色结果显示，经细胞因子组合处理3天后，类器官管腔内活化的半胱天冬酶-3阳性细胞数量增加了约2.5倍，明确证实了促炎因子诱导了肠上皮细胞的程序性死亡。
脂质组学分析揭示“凋亡脂质组”特征
利用超高效液相色谱串联质谱技术进行的非靶向脂质组学分析发现，细胞因子处理显著改变了上皮细胞的脂质构成。在检测到的1990种脂质中，有58种发生显著变化，其中56种上调。上调的脂质主要分为三类：醚连接磷脂、鞘磷脂和神经酰胺。后两者是众所周知的凋亡相关脂质，神经酰胺水平的升高尤其被视为细胞凋亡的关键生物标志。主成分分析和层次聚类分析均清晰地将处理组与对照组的脂质谱区分开来。
凋亡脂质在空间上的定位
为了在空间上定位这些脂质变化，研究采用了大气压扫描微探针基质辅助激光解吸电离质谱成像技术。结果显示，在未经处理的对照类器官中，管腔内几乎为空腔，而在细胞因子处理的类器官管腔内，则充满了细胞碎片。磷脂酰胆碱信号主要分布在上皮细胞区域，而一种特定的神经酰胺（Cer d34:1）的信号在处理组类器官的管腔碎片中特异性富集，这与凋亡细胞的定位高度吻合，提示Cer d34:1可作为细胞因子诱导凋亡的潜在分子标志物。
上皮屏障紧密连接蛋白表达的意外发现
尽管在体研究中炎症性肠病常伴随上皮屏障功能受损（“肠漏”），但本研究的类器官模型却显示出不同的结果。对多种紧密连接蛋白（claudin）的基因表达分析发现，具有屏障增强作用的claudin-3和claudin-4的表达显著上调，而孔道形成性claudin（如claudin-2）的表达未发生变化。这提示在本研究模型条件下，促炎因子并未诱导典型的屏障功能减弱基因表达谱，这可能与类器官模型缺乏免疫细胞、神经元等其他关键细胞类型的相互作用有关，也可能是上皮应对管腔压力增大的一种代偿反应。
研究意义与展望
本研究系统阐明了促炎因子组合TNFα/IL-1β/IFN-γ如何通过调控氯离子分泌、时相性改变钙信号通路以及诱导以神经酰胺和鞘磷脂累积为特征的“凋亡脂质组”，共同导致小肠上皮功能障碍。研究不仅揭示了炎症条件下上皮反应的复杂性，也展示了类器官模型结合前沿质谱成像技术在机制研究中的强大能力。然而，类器官模型缺乏体内微环境中的多种细胞互作，未来需要构建更复杂的共培养体系或器官芯片模型，以更全面地模拟炎症性肠病的病理生理过程，并为开发靶向上皮功能紊乱的新疗法提供思路。
