《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Metagenomic next-generation sequencing for diagnosis of immune checkpoint inhibitor-associated pneumonitis: a retrospective comparative clinical performance study
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本综述系统回顾了宏基因组下一代测序（mNGS）在区分免疫检查点抑制剂相关肺炎（CIP）与感染性肺炎中的诊断价值。研究显示mNGS具有显著优势：敏感性达88%，特异性94%，检测时间仅24小时（传统方法121.5小时）。该技术为免疫治疗患者肺部并发症的精准鉴别提供了新范式，对临床决策具有重要指导意义。
引言
免疫检查点抑制剂（ICIs）包括针对程序性死亡蛋白1（PD-1）、程序性死亡蛋白配体1（PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）的抗体，通过释放抗肿瘤免疫反应改变了多种恶性肿瘤的治疗格局。然而，这些疗法可能因对自身组织的意外激活而引发免疫相关不良事件（irAEs）。其中，免疫检查点抑制剂相关肺炎（CIP）是最严重的肺部毒性之一，通常与相当高的发病率和死亡率相关。
CIP的发病率因研究和人群而异。在临床试验的荟萃分析中，任何级别肺炎的发病率约为3-5%，与PD-L1抑制剂相比，PD-1抑制剂的严重（≥3级）事件发生率更高（分别为3.6% vs 1.3%）。真实世界研究经常报告更高的发病率，可能反映了更广泛的患者异质性和合并症。CIP的发病时间可变，通常在ICI开始后数周至数月内（范围从约9天到超过19个月）。多项研究确定的风险因素包括既往肺部疾病（如间质性肺病）、既往胸部放疗、联合免疫治疗方案和基线肺部炎症标志物。
关键的是，目前尚无经过充分验证的诊断方法能够可靠地排除疑似CIP患者的感染性病因，尽管这对于准确诊断和适当管理至关重要。没有这样的工具，临床医生通常必须依赖常规微生物检测（CMT），其敏感性有限且检测时间长，特别是对于难培养、罕见或合并感染的病原体。这种缺乏经过验证的排除诊断方法直接导致诊断不确定性、正确治疗的延迟以及不必要的免疫抑制或不适当的抗菌药物使用可能造成的伤害。
临床上，CIP可能表现为非特异性症状（咳嗽、呼吸困难或低度发热）和影像学特征，如磨玻璃样混浊、实变或间质异常——这些模式与感染性肺炎显著重叠。由于这种重叠，CIP通常是一种排除性诊断，需要系统评估以排除感染、肿瘤进展、放射性肺炎或其他间质性肺病。常规微生物检测——包括培养、多重PCR、抗原/血清学检测和标准检测组合——通常用于评估这种情况下的感染性病因。然而，此类方法在此背景下有几个局限性：许多难培养、罕见或合并感染的病原体无法通过靶向方法检测到，限制了敏感性和覆盖范围；基于培养的技术通常需要数天至数周，延迟了临床决策；已经接受经验性抗菌药物治疗或病原体负荷低的患者可能产生阴性结果；支气管镜/支气管肺泡灌洗（BAL）或肺活检等侵入性采样可以提高敏感性，但对患者有创伤。
鉴于这些缺点以及缺乏经过验证的诊断工具来可靠地排除疑似CIP中的感染，临床医生在区分感染性肺炎和CIP时经常面临不确定性，导致治疗困境（例如，在未识别的感染中开始使用类固醇，或因担心感染而暂停免疫抑制）。
宏基因组下一代测序（mNGS）是一种新兴的、无偏倚的方法，可对临床标本（如BALF、痰液、肺组织）中的所有核酸进行测序，从而能够同时检测细菌、病毒、真菌和寄生虫——无需预先靶向。最近几项针对免疫功能低下患者和严重肺炎队列的研究表明，与传统方法相比，mNGS可以显著提高病原体检出率。例如，在一项下呼吸道感染（LRTIs）队列中，mNGS在约93.3%的病例中鉴定出病原体，而培养方法仅为约55.6%。另一项最近的研究证实，在患有肺部感染的免疫功能低下和免疫功能正常患者中，mNGS相对于培养/传统PCR的阳性率更高。此外，在免疫功能低下的ICU患者中，mNGS已被证明有助于优化抗菌方案并为靶向治疗提供信息。
为了解决区分感染性肺炎和CIP的诊断工具关键空白，我们在接受ICIs并出现提示CIP或感染性肺炎的肺部浸润的癌症患者中进行了一项回顾性队列研究。我们的目的是比较mNGS与常规微生物检测在区分CIP和感染性肺炎方面的诊断性能（敏感性、特异性、阳性/阴性预测值）、检测时间和增量诊断效能。我们假设mNGS在准确性和速度上都会优于常规方法，从而改善这一具有挑战性场景下的临床决策。
材料与方法
研究设计
我们在河南科技大学第一附属医院（一家三级转诊中心）进行了一项回顾性队列研究，时间跨度为2022年2月1日至2024年1月30日。机构伦理委员会批准了该方案，由于研究的回顾性性质，知情同意的需要被豁免（K-2025-B028）。
本研究纳入了在入院期间至少接受过一次呼吸道样本mNGS分析以及至少一种形式的常规微生物检测（CMT）以排查感染的癌症患者（实体瘤或淋巴瘤）。符合条件的参与者是经组织学或细胞学证实患有恶性肿瘤的成年人，他们至少接受过一剂免疫检查点抑制剂（ICI；抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4）。所有患者均因新发或恶化的呼吸道症状（如咳嗽、呼吸困难或发热）住院，并伴有胸部影像学上新出现的肺部浸润，需要对其进行肺炎或肺炎的病因学评估。为确保诊断方式之间的可比性，仅纳入那些在索引住院期间接受过呼吸道标本mNGS检测以及由主治医师开具的CMT的患者。如果患者患有未接受ICI治疗的恶性肿瘤、缺乏CMT数据或临床信息不完整无法进行明确分类，则被排除。应用这些标准后，共有34名患者被纳入最终分析。患者入组流程图如图所示。
所有诊断为严重社区获得性肺炎（CAP）的患者在入院时均根据指南接受经验性抗菌治疗。此外， promptly进行包括血常规、降钙素原（PCT）、C反应蛋白（CRP）水平、微生物学分析、微生物培养和胸部影像学检查在内的全面评估。根据微生物培养和mNGS的结果调整治疗策略。
临床数据收集
在入院时为每位入组患者回顾性收集基线临床特征和结局。这包括性别、年龄、合并症（高血压、糖尿病、冠状动脉疾病、慢性阻塞性肺疾病[COPD]）、癌症类型、ICI类型等）、实验室参数（包括白细胞计数、中性粒细胞计数、血小板计数、CRP、PCT等）、住院时间、ICU住院时间、机械通气使用情况和院内死亡率。记录所有mNGS和CMT的实验室结果。CMT可包括培养（痰液、支气管肺泡灌洗[BAL]液、血液）、呼吸道病原体核酸PCR检测、抗原检测或血清学检测，具体由主治医师决定。我们还记录了从入院到获得mNGS和CMT检测结果的时间间隔。给予的治疗（抗生素、皮质类固醇）和反应被记录，但超出了本次诊断分析的范围。
mNGS和常规微生物学检测
所有入组患者均接受支气管镜检查以收集支气管肺泡灌洗液（BALF），并且相同的BALF标本平行进行mNGS和CMT检测。对于mNGS，根据我们之前发布的方案：将1.2 mL BALF与1.2 mL无菌缓冲液混合在2 mL离心管中，然后使用BSP-100振荡破碎仪（杭州杰毅生物技术）进行细胞裂解，使用MD013试剂盒（杭州杰毅生物技术）提取基因组DNA，并在NGSmaster?自动化系统（MAR002，杭州杰毅生物技术）上进行文库构建——包括用于病毒检测的RNA逆转录、酶切、末端修复、末端腺苷化和接头连接——在Illumina NextSeq 550平台上进行高通量测序，每个文库产生约2000万条50碱基对的单端读长；对于生物信息学分析和物种鉴定，原始数据被解复用为fastq格式，通过过滤短读长（<35 bp）、低质量读长（phred分数<20）和低复杂性序列获得干净读长，使用bowtie2比对到grch38.p13基因组以去除人源序列，剩余的微生物读长使用Kraken2进行物种鉴定，并与定制的呼吸道病原微生物数据库进行比对以验证分类学分配。
微生物仅在满足以下条件时才被报告为阳性：（1）其读长计数超过实验室验证的阈值（设定为阴性对照样本的平均读长计数 + 3个标准差）以排除背景噪音；（2）在阴性对照（无菌水和空白提取对照）中未检测到相应的读长；（3）该微生物的相对丰度占总微生物读长的≥0.01%（以排除污染）。mNGS的检测周转时间（TAT）定义为从BALF采集到最终临床报告分发的时间。
CMT包括对BALF进行的标准护理检测，包括细菌、真菌和分枝杆菌培养（如果生长，则通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱[MALDI-TOF MS]进行表型鉴定，并使用肉汤微量稀释法进行抗菌药物敏感性试验）、革兰氏染色、分枝杆菌抗酸染色、针对常见呼吸道病毒（例如甲型/乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒）和非典型病原体（例如肺炎支原体、肺炎衣原体）的分子PCR检测，以及针对肺炎链球菌和嗜肺军团菌血清1型的尿抗原检测。CMT的TAT从BALF采集开始计算，到首次阳性结果（对于培养阳性病例）或——如果所有检测均为阴性——到最终阴性结果报告发出时（完成细菌/真菌的7天培养孵育后）。
结局定义和诊断标准
本研究的主要结局是最终的临床诊断，将每位患者分类为CIP或感染性肺炎。最终诊断由治疗临床团队确定，并通过回顾性图表审查确认，整合了所有可用的临床、影像学和实验室数据。次要结局侧重于mNGS和CMT在区分CIP和感染性肺炎方面的比较诊断性能。
CIP被定义为一种排除性诊断，基于呼吸科、肿瘤科和感染病科专家的多学科评估，符合已发表的文献和专家共识指南。符合条件的患者有ICI治疗（抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4抗体）的书面记录，并出现新发或恶化的呼吸道症状——包括呼吸困难、咳嗽、发热、胸痛或低氧血症——伴有影像学上新出现的肺部浸润，如磨玻璃样混浊、实变或间质改变。感染性病因（细菌、病毒或真菌）、肿瘤进展或浸润、放射性肺炎、误吸和心源性肺水肿被仔细排除。
感染性肺炎定义为具有明确感染临床证据和病原微生物学确认的肺炎。
为区分CIP和感染性肺炎，所有患者均接受全面的微生物学评估，包括BALF的CMT和mNGS。任何可识别病原体的缺失——特别是具有足够测序深度的阴性mNGS结果——被认为是支持排除感染的强有力证据。所有病例均由不知晓研究假设的多学科裁定小组（呼吸科、肿瘤科、感染病科）独立审查。在整合临床、影像学、微生物学和治疗反应数据后，每个病例通过共识被分类为CIP或感染性肺炎。此外，对于微生物学阳性的病例，多学科裁定小组通过整合预定义标准进一步区分真实感染与定植，这些标准包括病原体负荷（定量mNGS读长计数和相对丰度）和病原体类型、临床表现、炎症生物标志物、影像学分布模式以及对靶向治疗的反应。在停用ICI并使用皮质类固醇或免疫抑制治疗后出现临床改善，且对抗菌治疗无反应，被视为支持CIP诊断的额外确认证据。
统计分析
对整体队列的基线特征进行总结，并在CIP组与感染性肺炎组之间进行比较。连续变量（如年龄、CRP）以中位数和四分位距（IQR）表示，并使用Mann-Whitney U检验进行比较。分类变量（如性别、癌症类型分布）酌情使用卡方检验或Fisher精确检验进行比较。通过计算敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）、阳性似然比（PLR）和阴性似然比（NLR）来评估mNGS和CMT在识别CIP方面的诊断性能，使用CIP与感染性肺炎的最终临床诊断作为参考标准。我们还为每种诊断方式构建了受试者工作特征（ROC）曲线。ROC曲线是通过改变判断病原体阳性的严格阈值（从而对CIP与感染性肺炎进行分类）来生成的。最后，我们比较了mNGS与CMT的诊断周转时间；由于每个患者是配对检测，使用Wilcoxon符号秩检验来评估结果时间的差异。双尾P值 < 0.05被认为具有统计学意义。所有分析均使用R（版本4.4.0）进行。
结果
基线特征
本研究是一项回顾性队列研究，连续纳入了2022年2月至2024年1月期间在河南科技大学第一附属医院诊断为癌症并接受BALF mNGS检测的152名患者。我们总共排除了108名患者：98名从未接受过免疫检查点抑制剂治疗，5名肺部改变被判定为肿瘤进展所致，3名发现肺栓塞，2名临床记录不完整不适合进行适当裁定。最终，34名患者被纳入研究。在这些患者中，16名被裁定为CIP，18名为感染性肺炎。患者入组流程如图所示。
CIP组和感染性肺炎组之间的人口统计学和临床特征比较总结见表1。中位年龄为64.5岁（IQR 58.0–70.0），组间差异很小（CIP：65.5 [58.0–70.5] vs 感染性肺炎：63.5 [54.0–70.0]，P = 0.400）。大多数患者为男性（79.4%），且CIP组比例更高（93.8% vs 66.7%，P = 0.090）。组间合并症（包括高血压、糖尿病、COPD和冠状动脉疾病）的分布无统计学显著差异（所有P > 0.05）。吸烟史常见（55.9%），无显著差异（CIP为62.5% vs 感染性肺炎为50.0%，P = 0.510）。实验室检查方面，中位WBC、中性粒细胞百分比和血小板计数无显著差异。然而，CIP组的淋巴细胞计数较高（1.18 ×109/L vs 0.53 ×109/L，P = 0.023），PCT较低（0.10 ng/mL vs 0.20 ng/mL，P = 0.045）。CIP组的C反应蛋白水平倾向于较低，但未达到统计学显著性（55.31 vs 97.05，P = 0.073）。
关于癌症类型，肺癌最常见（55.9%），其次是食管癌。各组间肿瘤类型的分布无显著差异（P = 0.551）。对于免疫检查点抑制剂类型，抗PD-1最常用（总体76.5%），其次是抗PD-L1（20.6%）和抗CTLA-4（2.9%），组间无显著差异（P = 0.405）。住院过程和结局大致相当：中位住院时间为21.5天（IQR 15.0–33.0），38.2%入住ICU，23.5%使用机械通气。这些结局在CIP组和感染性肺炎组之间无显著差异（所有P > 0.05）。感染性肺炎组的院内死亡率高于CIP组（33.3% vs. 6.3%），尽管该差异未达到统计学显著性（P = 0.090）。
mNGS与CMT的病原体检测
在18名感染性肺炎患者中，mNGS成功地在17例（94%）中检测到至少一种致病病原体。鉴定出的病原体包括常见细菌（例如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌）和机会性微生物（例如耶氏肺孢子菌、诺卡菌属、曲霉属）。相比之下，CMT仅在18例感染病例中的6例（33%）中检测到病原体。相反，在最终诊断为CIP的16名患者中，mNGS在14例（88%）中正确得出阴性结果（未检测到显著病原体），而CMT在16例中的11例（69%）中为阴性。CIP患者中的两个mNGS假阳性结果涉及铜绿假单胞菌和曲霉属。前者可能归因于慢性肺病患者的定植，而后者被认为归因于合并的曲霉病而非免疫相关性肺炎。
总体而言，mNGS的病原体检出率为56%（34名患者中有19名至少鉴定出一种病原体），显著高于常规微生物检测32%的检出率。
mNGS和CMT的诊断性能
我们进一步分析了mNGS和CMT在区分CIP与感染性肺炎（尤其是感染性肺炎）方面的诊断性能。以最终临床诊断作为金标准，mNGS在区分CIP和感染性肺炎方面显著优于CMT。mNGS的敏感性达到88%，特异性为94%，PPV为93%，NPV为89%，似然比良好（PLR 15.75，NLR 0.13）。相比之下，CMT的敏感性和特异性分别仅为69%和33%，PPV为48%，NPV为55%，PLR为1.03，NLR为0.94（表2）。这些结果表明，mNGS提供了可靠的诊断信号，能够可靠地确认或排除CIP，而传统检测在此背景下效用有限。
mNGS和CMT的诊断周转时间
一个重要的实际发现是获得结果的时间差异。从样本采集到诊断结果的时间，mNGS显著短于常规方法。mNGS的中位周转时间为24小时（IQR 22.0–30.8小时），而常规检测组合的中位时间为121.5小时（约5天；IQR 80.5–156小时）。该差异具有高度统计学显著性（P < 0.001）（图2）。在我们的研究中，mNGS显著更快的周转时间意味着，对于许多患者，我们可以在常规检测最终完成之前很久就识别出感染性微生物或断定其不存在。
讨论
在这项针对接受ICIs并疑似肺炎的癌症患者的回顾性队列中，我们发现mNGS在区分CIP与感染性肺炎方面明显优于常规微生物检测：其敏感性达到88%，特异性达到94%，远超过传统方法实现的69%和33%。据我们所知，这是首批直接比较mNGS与标准诊断在ICI相关肺炎背景下应用的研究之一。这些发现突出了mNGS在此背景下的两个关键优势：卓越的诊断准确性和显著缩短的病因确定时间。重要的是，mNGS能够更可靠地排除感染，解决了CIP诊断中的一个核心临床挑战——即CIP诊断通常需要可靠地排除感染性病因，作为安全启动免疫抑制的先决条件，这一问题在CIP诊断共识和专家综述中反复强调。
尽管先前的许多研究已经记录了mNGS在改善免疫功能低下或危重患者病原体检测方面的附加价值，但大多数研究侧重于一般肺炎队列，而非区分CIP这一特定挑战。例如，在免疫功能低下宿主中，BALF mNGS已被证明比常规检测将微生物检出率提高20~40个百分点，特别是在诊断机会性感染方面，如耶氏肺孢子菌（敏感性从约28%提高到约100%）。然而，这些研究并未解决竞争性诊断场景，即病原体检测缺失本身对支持非感染性免疫介导的肺损伤具有诊断价值——这是近期研究强调的CIP诊断路径中的核心要求。
相比之下，关于CIP的文献强烈强调免疫介导性肺炎与感染性肺炎之间的临床和影像学重叠，并警告频繁的错误分类可能导致对隐匿感染的过度免疫抑制或对真正CIP的类固醇治疗延迟。先前的综述和专家共识承认CIP诊断通常取决于排除感染性病因，但有效的辅助排除工具仍然有限。换句话说，虽然mNGS已被提倡用于感染诊断，但其在排除感染以支持CIP诊断方面的直接作用在现有研究中相对未被探索。
我们的研究通过证明在接受ICIs治疗并出现疑似肺损伤的癌症人群中，mNGS不仅能在病原体存在时检测到它们，而且还能以高置信度产生阴性结果，从而在适当的临床背景下为CIP提供有力支持，有助于填补这一空白。在我们的接受ICIs治疗并出现疑似肺损伤的癌症患者队列中，mNGS在诊断准确性上明显优于常规微生物学方法。敏感性为88%，特异性为94%（而CMT分别为69%和33%），mNGS不仅能够可靠地识别真正的CIP病例（通过在免疫相关性肺炎中“排除”病原体），而且能在感染存在时检测到感染。实际上，阴性mNGS结果（未检测到病原体）对CIP的阳性预测值约为93%，这至关重要：在隐匿感染的患者中误诊CIP并进行免疫抑制可能
