《Frontiers in Microbiology》：The optimal dietary crude protein level improves goat production performance by enhancing the body’s antioxidant function and energy metabolism
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本研究探讨了日粮不同粗蛋白(CP)水平对生长山羊生长性能、养分消化率、氮沉积、瘤胃发酵、微生物群落及血清代谢组学的影响。结果发现，14% CP水平能通过调控瘤胃微生物组成（如增加Burkholderia和Bacillus，减少Pseudomonas和Salmonella）、增强机体抗氧化功能（如上调金雀异黄素、5-羟基吲哚乙酸）及促进能量代谢（如富集TCA循环、谷胱甘肽代谢通路），从而显著改善平均日增重(ADG)和饲料转化率(FCR)，为山羊高效养殖提供了理论依据。
引言
川南黑山羊是中国西南地区的优良地方山羊品种，具有适应性强、耐粗饲、生长发育快、繁殖率高和肉质鲜美等优良特性。日粮蛋白质对动物至关重要，它参与多种代谢过程并在免疫系统中发挥关键作用。尽管已知适宜的日粮蛋白质水平可促进山羊生长，但其具体作用机制尚不完全明确。微生物宏基因组学和代谢组学为探索微生物世界及其与环境和宿主的相互作用提供了独特优势。本研究旨在从微生物和代谢组学角度，阐明适宜日粮蛋白质水平促进川南黑山羊生长的机制。我们假设，适宜的日粮蛋白质水平可通过改变瘤胃微生物组成，从而增强山羊的抗氧化和抗炎能力。
材料与方法
本研究选取50头4月龄、体重相近(13.75±0.27 kg)的川南黑山羊，随机分为5组，分别饲喂粗蛋白水平为8.12%、10.15%、12.17%、14.13%和16.18%的日粮，试验期70天，包括14天适应期。试验期间测定生长性能、养分表观消化率、氮代谢、瘤胃发酵参数，并对T8和T14组进行瘤胃微生物宏基因组学及血清代谢组学分析。数据采用SAS 9.4进行统计分析。
结果
生长性能：日粮粗蛋白水平对终末体重(FBW)、平均日增重(ADG)和饲料转化率(FCR)有二次曲线影响。随着日粮CP水平升高，ADG呈二次曲线上升，FCR呈二次曲线下降。T14组的ADG最高，FCR最佳。
养分表观消化率与氮代谢：日粮CP水平对干物质(DM)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的消化率有线性提高效应，而对氮摄入量(NI)、粪氮(FN)、尿氮(UN)、氮沉积(NR)及NR/NI有二次曲线影响。
瘤胃发酵参数：日粮CP水平对瘤胃氨态氮(NH3-N)、微生物蛋白(MCP)、总挥发性脂肪酸(TVFA)、乙酸盐、异丁酸盐和异戊酸盐浓度有二次曲线影响。T14组的NH3-N、MCP、TVFA、乙酸盐、丙酸盐浓度均高于T8组。
瘤胃微生物群落宏基因组学分析：与T8组相比，T14组的微生物多样性(Shannon和Simpson指数)更高。在门水平上，T14组变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度高于T8组，而厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度低于T8组。在属水平上，T14组的伯克霍尔德菌属(Burkholderia)和芽孢杆菌属(Bacillus)相对丰度显著升高，而假单胞菌属(Pseudomonas)和沙门氏菌属(Salmonella)相对丰度显著降低。KEGG通路分析显示，与T8组相比，T14组瘤胃微生物中与氨基酸代谢相关的通路丰度下调。
血清代谢组学分析：主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)显示T8与T14组血清代谢物谱明显分离。共鉴定出35种差异代谢物。在T14组中，金雀异黄素、5-羟基吲哚乙酸、间甲酚、鸟氨酸、柠檬酸等14种代谢物上调，而L-异亮氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸等21种代谢物下调。差异代谢物主要富集于组氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢以及柠檬酸循环(TCA循环)通路。代谢网络图显示，T14组的能量代谢和抗氧化代谢通路更为活跃。相关性分析显示，血清金雀异黄素浓度与芽孢杆菌属丰度呈正相关，与假单胞菌属丰度呈负相关。
讨论
生长性能：本研究中，随着日粮蛋白质水平从8%增加到14%，山羊的ADG和FCR显著改善，这与前人研究一致。T14组(14% CP)表现最佳，而先前研究报道16%和17%为最佳，差异可能与山羊品种和年龄有关。
养分表观消化率与氮代谢：日粮蛋白质水平显著影响养分的表观消化率。T14组NDF和ADF消化率高于T8组，这可能是因为更多可降解蛋白进入瘤胃，为微生物生长提供了更多氮源。随着日粮蛋白质水平增加，氮摄入量、粪氮和尿氮增加，氮沉积也增加，表明适宜的蛋白质水平有利于提高山羊的氮存留。
瘤胃发酵参数：日粮蛋白质水平未显著影响瘤胃pH值，其保持在正常范围(5.5–7.5)内。NH3-N浓度随日粮蛋白质水平升高呈线性增加，这与蛋白发酵加速有关。较高的日粮蛋白质水平导致瘤胃TVFA浓度升高。T14组丙酸浓度高于T8组，丙酸是反刍动物糖异生的主要前体，表明T14组山羊可能具有更高的能量利用效率，这有助于其更好的生长性能。支链脂肪酸(异丁酸和异戊酸)浓度的增加与氨基酸分解增强有关。
瘤胃微生物宏基因组学：蛋白质含量增加与瘤胃微生物多样性(Shannon和Simpson指数)增加相关。本研究中厚壁菌门是主要菌门，而非拟杆菌门和变形菌门。厚壁菌门含有一些致病菌，在一定程度上反映了胃肠道菌群结构失调或不稳定，并与炎症和代谢综合征有关。T14组表现出较强的抗炎作用，推测高蛋白日粮可增强山羊的消化吸收。另一原因是变形菌门与蛋白质分解有关，其含有的脲酶可快速分解尿素。在属水平上，T14组沙门氏菌属和假单胞菌属的流行率低于T8组，而伯克霍尔德菌属和芽孢杆菌属更为丰富。沙门氏菌是山羊胃肠道疾病的重要致病因子，假单胞菌则常与山羊散发性乳腺炎相关。芽孢杆菌作为益生菌，可通过产生多种生物活性物质、调节免疫系统和影响营养吸收来直接增强宿主健康。伯克霍尔德菌的持续瘤胃灌注可保护山羊免受植物中毒。综上所述，将日粮蛋白质从8%增加到14%，可通过减少病原菌相对丰度、增加有益菌相对丰度来改善胃肠道健康，最终增强纤维和蛋白质等营养物质的消化吸收。在KEGG三级通路上，T8组与氨基酸代谢相关的瘤胃微生物基因相对丰度显著高于T14组，这可能是T8组蛋白质不足时微生物为维持正常生长而发生的补偿性增加。
血清代谢组学分析：代谢组学分析结果表明，与T8组相比，T14组具有抗炎和抗氧化特性的物质(如金雀异黄素和5-羟基吲哚乙酸)浓度显著更高。金雀异黄素可通过抑制NF-κB降低炎症反应，并恢复抗氧化酶功能。5-羟基吲哚乙酸可作为G蛋白偶联受体(GPR35)的新型配体，通过激活GPR35增强中性粒细胞向炎症部位的募集，促进病原菌清除。T14组血清γ-谷氨酰半胱氨酸和L-半胱氨酸浓度低于T8组。γ-谷氨酰半胱氨酸是合成谷胱甘肽的前体，有助于机体清除有害氧自由基并缓解各种炎症损伤。其水平降低可能归因于它们被用于谷胱甘肽的生物合成。本研究观察到谷胱甘肽代谢通路富集。此外，假单胞菌属的相对丰度与抗炎代谢物金雀异黄素呈负相关，而伯克霍尔德菌属和芽孢杆菌属与同种代谢物呈正相关。因此，将日粮蛋白质水平从8%提高到14%，可增强机体的抗炎和抗氧化能力，从而改善生产性能。T8组血清磺胺甲恶唑浓度低于T14组，这表明T14组山羊可能拥有更强大的代谢系统，能更快地消除磺胺甲恶唑。精氨酸是细胞中最重要的氨基酸之一，是合成一氧化氮、尿素、多胺、脯氨酸、谷氨酸和肌酸等多种化合物的前体。精氨酸和鸟氨酸在体内的相互转化可能解释了本研究中鸟氨酸和亚氨基精氨酸的变化。与T8组相比，T14组精氨酸和脯氨酸代谢通路富集。在体内，大部分能量由三羧酸(TCA)循环这一关键代谢途径提供。柠檬酸是TCA循环的主要中间产物，在介导糖酵解和糖异生中起着关键作用。葡萄糖酸作为葡萄糖衍生物，其水平升高表明葡萄糖可用性增加。本研究发现，与T8组相比，T14组柠檬酸和葡萄糖酸水平显著增加，这表明能量代谢可能增强，从而为T14组山羊的生长提供了更多的能量可用性，这进一步阐明了T14组山羊生产性能优于T8组的原因。
结论
为探寻生长川南黑山羊的最佳粗蛋白需要量，本研究开展了生长、消化和代谢试验。结果表明，随着日粮CP水平增加，假单胞菌属和沙门氏菌属相对丰度降低，伯克霍尔德菌属和芽孢杆菌属相对丰度增加，导致总VFA、乙酸盐、丙酸盐和异丁酸盐含量升高。干物质、粗蛋白和中性洗涤纤维消化率提高，氮沉积也增加。代谢组学分析表明，提高蛋白质水平可上调金雀异黄素和5-羟基吲哚乙酸等抗氧化物质，以及TCA循环终产物柠檬酸，从而富集精氨酸生物合成、TCA循环和谷胱甘肽代谢通路，进而促进山羊生长性能。二次回归模型根据平均日增重确定，生长川南黑山羊的最佳日粮粗蛋白水平为14%。
