《Frontiers in Microbiology》：Characterization of viral diversity in wild marmot blood from the Qinghai–Tibet Plateau
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本研究采用高通量测序技术首次系统揭示青藏高原旱獭血液病毒组特征，发现包括圆环病毒科（Anelloviridae）、黄病毒科（Flaviviridae）在内的多种新型病毒，证实蜱传脑炎病毒（TBEV）与人类毒株高度同源，为野生动物源人兽共患病预警提供重要分子依据。
1 引言
旱獭作为青藏高原关键啮齿类物种，不仅是鼠疫等重要细菌性疾病的储存宿主，更携带多种病毒性病原体。近年研究发现，这类大型地栖松鼠可通过蜱、蚤等媒介生物传播血液病毒，其与人类活动区域的重叠分布加剧了人兽共患病传播风险。尤为值得关注的是，旱獭体内发现的蜱传脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus, TBEV）喜马拉雅亚型，提示其可能在虫媒病毒传播链中扮演放大宿主角色。本研究通过整合新一代测序（NGS）与生物信息学技术，对青海玉树和果洛地区的70份旱獭血液样本进行系统性病毒组解析，旨在揭示病毒多样性特征及其潜在公共卫生意义。
2 方法
2.1 样本采集与处理
采用符合江苏大学伦理委员会批准的标准化流程，通过心脏穿刺采集50只玉树地区和20只果洛地区旱獭血液样本。样本经离心去除上清后，于-80°C超低温保存。前处理阶段采用0.45μm滤膜去除细胞碎片，并通过DNase I/RNase A双酶消化法选择性富集病毒颗粒保护性核酸。
2.2 测序与生物信息学分析
使用Illumina NovaSeq 6000平台进行250bp双端测序。原始数据经去重复和质控后，通过DIAMOND BLASTx比对非病毒蛋白数据库排除假阳性。病毒序列鉴定采用de novo组装与参考基因组映射相结合策略，并通过HMMER3比对vFam数据库挖掘远缘同源病毒。系统发育分析采用MrBayes 3.2.7进行贝叶斯推断，辅以MEGA 10.1.8的最大似然法验证。蛋白结构预测依托AlphaFold3服务器，核定位信号（NLS）分析采用cNLS Mapper工具。
3 结果
3.1 病毒组概览
物种累积曲线显示70个测序文库中病毒家族数量趋于饱和，表明测序深度足以反映病毒群落特征。共鉴定出18个完整病毒基因组，包括圆环病毒科（n=14）、微病毒科（n=1）、细小病毒科（n=1）、多瘤病毒科（n=1）和黄病毒科（n=1）的代表性序列。
3.2 病毒群落地理差异
玉树地区病毒α多样性显著高于果洛（p<0.01），其病毒群落以长尾病毒科（Siphoviridae）和肌尾病毒科（Myoviridae）等噬菌体为主导。主坐标分析（PCoA）显示两地病毒β多样性存在显著分离（p=0.01），提示生态因子对病毒组成的塑造作用。
3.3 圆环病毒科新发现
获得14条圆环病毒科序列，其中Qblood059_12572呈现完整环状基因组。系统发育分析显示这些序列与旱獭粪便和组织来源病毒聚集成簇，氨基酸相似度69%-94%。结构预测发现其ORF1蛋白具有典型果冻卷折叠结构，但缺乏C末端经典核定位信号（cNLS），符合短投射结构域圆环病毒特征。
3.4 蜱传脑炎病毒证据
鉴定出长6.55kb的黄病毒科序列Qblood061_6473，其多蛋白与人类脑组织分离株（KC414090）氨基酸相似度达94.31%。系统发育树确认该病毒属于正黄病毒属（Orthoflavivirus），是首次在旱獭血液中检测到该属病毒。
3.5 细小病毒科与多瘤病毒科新株
新型细小病毒Qblood060_22586（4,599bp）的复制蛋白（Rep）与依赖细小病毒属（Dependoparvovirus）同源性达88.63%。多瘤病毒Qblood079_1103（5,188bp）的VP1蛋白与旱獭皮肤源多瘤病毒同源性86.72%。其大T抗原（LTA）预测含典型LXCXE基序、原点结合域（OBD）和SF3解旋酶域，并在LXCXE与OBD之间存在双分型核定位信号，符合哺乳动物感染多瘤病毒的分子特征。
4 讨论
本研究通过高通量测序技术首次绘制青藏高原旱獭血液病毒组图谱，揭示其作为圆环病毒科、黄病毒科等重要病毒自然宿主的潜力。蜱传脑炎病毒与人类毒株的高度同源性提示旱獭可能在病毒传播循环中起桥梁作用。地域性病毒群落差异反映了生态因子对病毒演化的塑造，而多瘤病毒LTA蛋白保守功能域的分析为宿主适应性进化研究提供新视角。未来需通过病毒分离和血清学实验验证这些病毒的生物学功能，为野生动物源疾病预警提供理论基础。
