《Frontiers in Genetics》：Identification and functional characterization of a novel pathogenic COL1A1 splicing variant in a Chinese family with osteogenesis imperfecta
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本研究通过全外显子测序在中国成骨不全症（OI）家系中发现COL1A1基因新型剪接位点变异c.298+1G>A，并利用小基因（minigene）模型证实其引起外显子跳跃及移码突变，导致胶原蛋白合成量不足（haploinsufficiency），为轻度I型OI的分子诊断与遗传咨询提供重要依据。
引言
成骨不全症（Osteogenesis Imperfecta, OI）是一种罕见的遗传性结缔组织疾病，全球发病率约为1/15,000–1/20,000，主要临床特征为骨脆性、反复骨折和骨骼畸形。其病因90%以上与胶原蛋白生物合成相关基因的致病性变异有关，其中COL1A1和COL1A2基因突变最为常见。OI的临床表现具有高度异质性，从轻度表型到围产期致死型不等，根据Sillence分型可分为I–IV型。COL1A1和COL1A2分别编码I型前胶原的α1和α2链，其突变通过两种机制导致OI：一是定量缺陷（单倍体不足，haploinsufficiency），常由无义、移码或剪接突变引起，导致正常胶原合成量减少约50%，多表现为轻度I型OI；二是定性缺陷（显性负效应，dominant-negative effect），多由甘氨酸替换等错义突变导致胶原三螺旋结构异常，常引起严重表型（II–IV型）。近年来研究发现，不同人群的OI遗传背景存在显著差异，COL1A1/COL1A2突变率在西方人群和日本队列中高达90%，而在印度和中国散发病例中分别仅为47.6%和40%。因此，针对特定人群的新突变功能验证对精准诊断至关重要。
材料与方法
伦理批准与研究对象
本研究经广西医科大学第八临床医学院伦理委员会批准（E2025-003-01），所有参与者均签署知情同意书。研究纳入一个中国OI家系，先证者为11岁女童，临床表现为多次骨折、蓝色巩膜、身高体重低于同龄人（身高Z值-2.27，体重Z值-1.56），影像学显示肱骨骨折愈合痕迹、腰椎压缩性畸形及左股骨颈骨折内固定术后改变。
全外显子测序与变异验证
采集家系成员（2例患者、2例健康者）外周血进行全外显子测序，使用MGISEQ-2000平台，平均测序深度200×，覆盖度98.5%。数据分析参照ACMG指南，通过Sanger测序验证候选变异。
剪接效应预测与功能分析
利用SpliceAI算法预测变异剪接影响（阈值>0.5为致病性）。构建两种小基因载体（pcMINI-COL1A1和pcMINI-N-COL1A1），将包含野生型或突变型（c.298+1G>A）的COL1A1片段（内含子1–外显子2–内含子2）插入载体，转染HEK293T细胞后提取RNA进行RT-PCR，并通过凝胶电泳和Sanger测序分析转录本。
结果
临床特征与变异共分离
家系中3例患者均携带COL1A1杂合剪接位点变异c.298+1G>A，且与疾病表型共分离。先证者及其母亲、祖母均表现为蓝色巩膜、多发骨折和身材矮小，但其妹妹未携带变异且无异常表型。
剪接异常的功能验证
SpliceAI预测该变异导致供体位点丢失（Donor Loss score=1.00）并激活隐性供体位点（Donor Gain score=0.66）。小基因实验显示，突变型载体产生多种异常剪接转录本：在pcMINI-COL1A1系统中，主要产物为外显子2完全跳跃（band d），其次为部分跳跃（band b/c）；在pcMINI-N-COL1A1系统中，优势产物为外显子2部分缺失（band b）。这些异常转录本均引起移码和提前终止密码子（premature termination codon, PTC），提示其可能通过无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated decay, NMD）途径被清除。
讨论
本研究首次在中国OI家系中报道COL1A1 c.298+1G>A剪接变异，并通过功能实验证实其导致外显子跳跃和移码突变，符合单倍体不足机制。该变异位于基因早期区域（内含子2），其诱导的PTC转录本易被NMD降解，避免产生显性负效应蛋白，从而解释患者轻度I型OI表型。此发现扩展了COL1A1突变谱，强调了剪接变异功能验证在OI分子诊断中的必要性。局限性在于仅基于单一家系，且采用非骨源性细胞模型，未来需通过患者原代细胞进一步验证胶原蛋白表达水平。
结论
COL1A1 c.298+1G>A变异通过破坏剪接完整性引起胶原合成定量缺陷，是导致中国人群轻度OI的重要致病因素。结合多组学分析与功能研究有助于提升罕见病遗传咨询的准确性。
