《Frontiers in Immunology》：The TPx protein of Taenia solium metacestode regulates Treg and Th17 cell differentiation via the TGF-β/Smad signaling pathway
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本研究发现猪带绦虫囊尾蚴TPx蛋白通过激活TGF-β/Smad信号通路，上调Treg细胞关键转录因子Foxp3表达并抑制Th17细胞分化因子RORC(γt)，诱导Treg/Th17细胞失衡，揭示寄生虫免疫逃逸新机制，为囊尾蚴病免疫干预提供靶点。
1 引言
猪带绦虫（Taenia solium）作为一种被忽视的人畜共患寄生虫，其引发的囊尾蚴病（Cysticercosis）是全球食源性寄生虫感染的首要病因。神经囊尾蚴病（Neurocysticercosis, NCC）被世界卫生组织列为被忽视的热带疾病，每年导致约5万人死亡。当前治疗手段有限，而囊尾蚴诱导的复杂免疫病理机制是疫苗研发的主要障碍。
CD4+T细胞在抗寄生虫免疫中发挥核心作用，其中调节性T细胞（Treg）与辅助性T细胞17（Th17）的动态平衡决定感染结局。前期研究表明，猪带绦虫囊尾蚴排泄分泌抗原（Excretory-Secretory Antigens, ESAs）可通过激活TGF-β/Smad信号通路调控宿主免疫反应。该通路是T细胞分化的关键调节者：TGF-β与受体（TβR-I/II）结合后激活Smad2/3蛋白，进而入核调控谱系特异性转录因子表达，如Treg细胞的Foxp3和Th17细胞的ROR-γt。通过蛋白质组学分析，研究者从ESAs中鉴定出硫氧还蛋白过氧化物酶（Thioredoxin Peroxidase, TPx）蛋白，并证实其可诱导仔猪Treg/Th17失衡，促进免疫逃逸。
2 材料与方法
2.1 TPx蛋白制备
通过生物信息学分析预测TPx蛋白亲水性和T细胞抗原表位，全基因合成TPx编码基因并克隆至pcDNA3.4载体。重组质粒转染Expi 293细胞后，通过Ni柱纯化获得重组TPx蛋白（内毒素<10 EU/mg），经SDS-PAGE和Western blot验证。
2.2 Jurkat细胞培养与刺激
人白血病T淋巴细胞Jurkat细胞（Clone E6-1）用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养。细胞经0.5 ng/ml PMA和0.5 μM离子霉素预处理12小时激活后，分别以500 ng/ml TPx蛋白刺激24、48、72小时，对照组以等体积培养基处理。
2.3 流式细胞术分析
分别使用APC标记的抗CD4抗体、PE标记的抗CD25抗体和FITC标记的抗CD127抗体检测CD4+CD25+CD127-Treg细胞；另用APC标记的抗CD4抗体和PerCP-Cy5.5标记的抗IL-17A抗体检测CD4+IL-17A+Th17细胞。
2.4 转录组测序与生物信息学分析
提取TPx处理0、48、72小时的Jurkat细胞总RNA，通过DESeq2软件筛选差异表达基因（p<0.05且FC>2），进行GO功能注释、KEGG通路富集和GSEA分析。
2.5 Western blot检测
检测TGF-β1、TGF-βR2、Smad4、Foxp3、RORC(γt)、Smad3及磷酸化Smad3（p-Smad3）蛋白表达，以GAPDH为内参。
3 结果
3.1 TPx蛋白对Treg/Th17分化的影响
流式结果显示，TPx处理24小时可抑制Treg细胞分化（P<0.05），但对Th17细胞无显著影响；处理48和72小时后，Treg分化显著促进，Th17分化明显抑制（P<0.05）。Treg/Th17比值在48和72小时显著升高，呈现以Treg为主导的免疫抑制状态。
3.2 转录组学分析
与对照组相比，TPx处理48小时组鉴定出108个差异基因（64个上调，44个下调），72小时组有115个差异基因（56个上调，59个下调）。GSEA分析显示，TGF-β信号通路和Th17分化通路在48小时组均被激活，而72小时组TGF-β通路持续激活，Th17分化通路被抑制。热图分析证实TGF-β、TGF-βR1、TGF-βR2、SMAD3等基因表达随TPx刺激时间延长而上升，而SMAD4、FOS、RUNX1等基因表达下降。
3.3 TGF-β/Smad通路关键蛋白表达
Western blot结果显示，TPx处理48和72小时后，TGF-β1、TGF-βR2和p-Smad3蛋白表达显著上调（P<0.05），Smad4表达无显著变化。Foxp3蛋白在48和72小时均显著增加（P<0.05），而RORC(γt)蛋白在72小时显著降低（P<0.05）。
4 讨论
本研究首次揭示TPx蛋白通过时间依赖性方式调控Treg/Th17平衡：早期（24小时）抑制Treg分化，中晚期（48-72小时）促进Treg分化并抑制Th17分化。这种动态变化与TGF-β/Smad通路的激活密切相关。TPx通过上调TGF-β1及其受体表达，促进Smad3磷酸化，进而增强Foxp3转录活性，同时抑制RORC(γt)表达，最终导致免疫抑制偏倚。
值得注意的是，转录组与蛋白水平结果存在差异：Foxp3 mRNA在72小时下调，但其蛋白表达却显著增加，提示TPx可能通过翻译后修饰（如泛素化降解抑制）稳定Foxp3蛋白。此外，TPx下调RUNX1表达可能进一步偏向Treg分化路径。通路富集分析还发现MAPK和PI3K/AKT信号通路被抑制，这两条通路通常促进炎症反应，其抑制可能协同增强TGF-β介导的免疫耐受。
5 结论
猪带绦虫囊尾蚴TPx蛋白通过激活TGF-β/Smad信号通路，动态调控Treg/Th17细胞分化平衡，晚期诱导以Treg为主导的免疫抑制状态，为寄生虫免疫逃逸提供新机制解释。该研究为囊尾蚴病的免疫干预策略提供了潜在靶点。
