《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：A multi-mics exploration of programmed cell death in non-obstructive azoospermia: identifying TLR4 as a central regulator and therapeutic target
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本综述通过多组学整合分析揭示了程序性细胞死亡（PCD）在非梗阻性无精子症（NOA）中的核心作用，首次通过孟德尔随机化（MR）证实TLR4是NOA的致病基因。研究通过蛋白互作（PPI）网络筛选出HIF1A、TLR4等10个枢纽基因，并利用LPS诱导的GC-1 spg (ts)细胞模型验证TLR4通过NF-κB通路加剧生精损伤。分子对接发现全氟辛酸（PFOA）等环境污染物可激活TLR4，而黄芩素等天然产物则能抑制其活性，为NOA的防治提供新策略。
背景
男性不育（MI）已成为全球公共卫生挑战，约18%的育龄男性受其影响。近50年来，西方人群精子浓度下降达52.4%，反映出严峻的生殖健康趋势。非梗阻性无精子症（NOA）作为男性不育的主要病因，占不育男性的10%，其发病机制与程序性细胞死亡（PCD）失调密切相关。目前已知至少18种PCD模式（如凋亡、焦亡、铁死亡等）参与睾丸微环境调控，但PCD在NOA中的具体作用机制尚未系统阐明。
方法
本研究整合GEO数据库中GSE4797、GSE45885等NOA相关数据集，通过差异表达分析筛选出2025个差异基因。从MSigDB等数据库收录18种PCD亚型相关基因（共1964个），韦恩分析鉴定出150个NOA-PCD交叉基因。通过GO/KEGG富集分析揭示这些基因主要调控细胞死亡、炎症、氧化应激等生物过程。利用STRING数据库构建蛋白互作（PPI）网络，结合Cytoscape的Centiscape插件拓扑分析（紧密度≥0.00281、介数≥240.538、度数≥7.415）筛选枢纽基因。采用两样本孟德尔随机化（MR）分析（以eQTLGen联盟数据为暴露，FinnGen数据库的1852例MI病例为结局），通过逆方差加权（IVW）法评估基因与疾病的因果关系。体外实验使用LPS（1 μg/mL）诱导GC-1 spg (ts)细胞炎症模型，TLR4抑制剂TAK-242（10 μM）干预，Western blot检测TLR4/NF-κB p65蛋白表达，EdU法评估细胞增殖。通过比较毒理基因组学数据库（CTD）筛选TLR4靶向化合物，AutoDockTools进行分子对接验证结合能（ΔG）。
结果
NOA-PCD基因功能特征
150个NOA-PCD基因显著富集于凋亡信号通路、自噬调控、细胞应激响应等生物学过程。KEGG分析提示PI3K-Akt、mTOR、Toll样受体等通路参与NOA发病。PPI网络鉴定出HIF1A、TLR4、MDM2、GPX4、SNCA、MTOR、CSNK2A2、ATG5、CTSS和PIK3CA共10个枢纽基因，其中TLR4在网络中度值最高。
TLR4的因果验证与表达定位
MR分析显示TLR4表达与NOA风险呈正相关（OR=1.16, 95%CI: 1.01-1.33, p=0.032），且通过异质性检验（Cochran’s Q p=0.99）和多重效性检验（MR-Egger截距p=0.66）。单细胞转录组数据显示TLR4主要在睾丸巨噬细胞和内皮细胞表达，支持细胞中表达中等。免疫组化证实其定位于生精小管内。
TLR4的体外功能验证
LPS诱导后GC-1 spg (ts)细胞中TLR4蛋白表达显著上调，EdU阳性细胞比例下降。TLR4抑制剂TAK-242处理可逆转LPS引起的增殖抑制，并降低NF-κB p65活化水平。
环境污染物与天然产物的TLR4靶向作用
分子对接发现双酚A（BPA，ΔG=-7.3 kcal/mol）、全氟辛酸（PFOA，ΔG=-8.4 kcal/mol）等7种环境污染物可与TLR4稳定结合。Western blot验证PFOA可协同LPS促进TLR4/NF-κB通路活化。相反，黄芩素（ΔG=-9.2 kcal/mol）、槲皮素（ΔG=-9.0 kcal/mol）等7种天然产物与TLR4具有高亲和力，其中黄芩素处理显著抑制TLR4表达并改善细胞增殖。
讨论
本研究首次通过多组学整合策略系统揭示PCD失调在NOA中的作用网络，明确TLR4为关键致病基因。环境污染物可能通过激活TLR4/NF-κB通路破坏血睾屏障，而黄芩素等天然产物则展现出治疗潜力。局限性在于样本来源异质性及细胞模型的单一性，未来需通过基因编辑和类器官模型深化机制研究。
结论
TLR4是连接PCD失调与NOA发病的核心枢纽，其靶向干预可能为男性不育提供新的防治策略。
