钙信号相关基因在膀胱癌中的预后意义及ATP2B4通过VDAC1/MCU通路调控线粒体钙离子水平的作用机制

《Frontiers in Immunology》：Prognostic significance of calcium signaling-related genes in bladder cancer and the role of ATP2B4 in regulating mitochondrial calcium ion levels via the VDAC1/MCU pathway

本综述聚焦膀胱癌（BLCA）中钙离子信号通路的调控网络，通过生物信息学与实验验证，首次构建了包含ATP2B4、BDKRB2、EDNRA、PDGFRA、EGFR和ADCY7六个基因的钙信号相关预后模型，证实其可作为独立预测患者总生存期、化疗及免疫治疗响应的有效标志物。深入研究发现，关键基因ATP2B4在膀胱癌中高表达，其下调可导致胞浆Ca2+浓度升高，激活VDAC1/MCU信号轴，引起线粒体Ca2+超载，最终诱导膀胱癌细胞凋亡，揭示了ATP2B4在肿瘤发生发展中的核心作用及新的治疗靶点潜力。

　　

引言

膀胱癌（BLCA）是泌尿系统常见的恶性肿瘤，发病率与死亡率高，治疗挑战巨大。钙离子（Ca²⁺）作为普遍存在的细胞内第二信使，在肿瘤发生、发展、转移及治疗反应中扮演着关键角色。然而，对于钙信号相关基因在膀胱癌中的系统性表达模式、预后价值及其潜在机制，此前尚缺乏整合性研究。本研究旨在填补这一空白，通过多组学分析与实验验证，深入探索钙信号网络在膀胱癌中的作用。

材料与方法

研究从TCGA和GEO数据库获取了膀胱癌患者的转录组与临床数据。通过差异表达分析，从178个钙信号相关基因中鉴定出32个在癌与正常组织间差异表达的基因。运用Cox回归和LASSO回归分析，筛选出与预后相关的基因，并构建了一个包含六个基因（ATP2B4, BDKRB2, EDNRA, PDGFRA, EGFR, ADCY7）的预后特征模型。通过外部数据集（GSE32894）验证了模型的可靠性。利用Kaplan-Meier生存分析、PCA、t-SNE和ROC曲线评估模型的预测性能。通过单因素与多因素Cox回归分析确认该特征是否为独立的预后指标。此外，还分析了该特征与免疫细胞浸润、肿瘤突变负荷（TMB）以及化疗和免疫治疗反应之间的关联。最后，通过体外和体内实验验证了关键基因ATP2B4的功能。

结果

1. 差异表达钙相关基因的鉴定与功能分析

在TCGA数据集中，共鉴定出32个差异表达的钙相关基因，其中16个上调，16个下调。蛋白互作网络、GO和KEGG富集分析表明，这些基因主要参与细胞内钙离子稳态、钙离子转运、钙通道活性等生物学过程，并富集于钙信号通路、cGMP-PKG信号通路等。

2. 钙相关六基因预后特征的构建与验证

通过LASSO Cox回归分析构建的风险评分模型包含六个基因。根据中位风险评分将患者分为高风险组和低风险组。分析显示，低风险组患者的总生存期显著优于高风险组。主成分分析和t-SNE分析表明两组患者在转录组层面存在明显分离。时间依赖性ROC曲线显示，该模型在TCGA数据集和外部验证集GSE32894中均表现出良好的预测效能（1年、3年、5年AUC值均高于0.6）。

3. 预后特征的临床相关性及独立性

风险评分与晚期临床特征（T3-T4期、N1-N3期、III-IV期）显著相关。单因素和多因素Cox回归分析均证实，该风险评分是膀胱癌患者总生存期的独立预后因素。结合风险评分和年龄构建的列线图，能有效预测患者3年及5年生存率。

4. 高风险组与低风险组的生物学通路与免疫微环境差异

基因集富集分析显示，高风险组显著富集于粘着斑、细胞因子-细胞因子受体相互作用、癌症通路、钙信号通路、TGF-β信号通路等与肿瘤进展和免疫调节相关的通路。低风险组则富集于氧化磷酸化、脂肪酸代谢等代谢相关通路。

免疫浸润分析揭示，低风险组中抗肿瘤免疫细胞（如滤泡辅助性T细胞、浆细胞）浸润更多，而高风险组则富含免疫抑制性细胞，如M2型巨噬细胞、调节性T细胞、癌症相关成纤维细胞和中性粒细胞。同时，高风险组中PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、HAVCR2等免疫检查点分子，以及IL-10、TGF-β等免疫抑制性细胞因子的表达水平更高，表明其处于免疫抑制微环境。

5. 对治疗反应的预测价值

在免疫检查点抑制剂治疗方面，基于IMvigor210数据集的分析表明，低风险组患者有更高的完全缓解/部分缓解率及更长的生存期。有趣的是，在卡介苗免疫治疗中，高风险组患者则显示出更好的反应。这可能与两组的肿瘤突变负荷差异有关，分析发现低风险组的TMB显著高于高风险组，而高TMB通常与更好的免疫检查点抑制剂疗效相关。

在化疗敏感性方面，低风险组对顺铂、多柔比星、吉西他滨等药物更敏感，而高风险组对长春瑞滨、甲氨蝶呤更敏感。此外，通过CMAP数据库筛选出番茄碱、萘哌地尔、哈尔明等十种可能具有抗膀胱癌潜力的候选小分子化合物。

6. 关键基因ATP2B4的功能机制研究

ATP2B4编码一种质膜钙ATP酶，负责将胞内Ca²⁺泵出细胞，维持胞浆低钙环境。实验发现，ATP2B4在膀胱癌组织中表达显著上调。在T24和5637膀胱癌细胞系中敲低ATP2B4，可抑制细胞增殖，并在小鼠移植瘤模型中抑制肿瘤生长。

机制上，敲低ATP2B4导致胞浆Ca²⁺浓度升高。升高的胞浆Ca²⁺激活了位于线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）和位于线粒体内膜的钙单向转运体（MCU）的表达，从而促进了Ca²⁺从胞浆向线粒体的转运，导致线粒体Ca²⁺超载。

线粒体钙超载进一步诱导线粒体膜电位下降、活性氧大量产生，并导致细胞色素c和凋亡诱导因子从线粒体释放至胞浆，最终激活Caspase-3等凋亡执行蛋白，诱导线粒体途径的细胞凋亡。而敲低MCU可以逆转ATP2B4敲低所引起的上述凋亡效应，证实了VDAC1/MCU通路在该过程中的核心地位。

讨论

本研究首次系统性地描绘了膀胱癌中钙信号相关基因的图谱，并构建了一个强大的六基因预后特征。该特征不仅能独立预测患者预后，还能区分不同的免疫微环境状态，并对化疗和免疫治疗（包括免疫检查点抑制剂和卡介苗）的疗效具有预测价值，有望为膀胱癌的个体化治疗提供新策略。对核心基因ATP2B4的深入功能解析，揭示了其通过VDAC1/MCU通路调控线粒体钙稳态和细胞凋亡的新机制，确立了ATP2B4作为膀胱癌潜在治疗靶点的重要地位。这些发现为理解钙信号在膀胱癌中的作用开辟了新视角，并为开发针对该通路的新型疗法奠定了理论基础。

结论

综上所述，本研究成功构建并验证了一个基于钙信号相关基因的新型预后特征，该特征在预测膀胱癌患者预后及治疗反应方面表现出色。其中，ATP2B4被鉴定为一个关键的促癌基因，其通过VDAC1/MCU通路调控线粒体钙离子转运和细胞凋亡的机制，为膀胱癌的靶向治疗提供了新的思路和潜在靶点。